Lab. 6:  Enzimas y membranas biológicas

 

Objetivos:

  1. Definir enzimas y describir la actividad enzimática en células.
  2. Diferenciar entre inhibición competitiva y no-competitiva.
  3. Discutir cómo diferentes factores pueden alterar la actividad enzimática.
  4. Describir los componentes de las membranas biológicas.
  5. Discutir varios factores que pueden afectar la integridad de las membranas.

 

Destrezas:

Trabajo individual y grupal.  Se enfatiza la división óptima de tiempo para tareas en grupos.  Se aprenderán técnicas de laboratorio.  Se practicarán destrezas de comunicación escrita y se reforzarán los conceptos de investigación científica.

 

Introducción:

 

El instructor debe introducir los términos generales del tema de hoy brevemente,  dejándo para la discusión final los términos más específicos.   Asegurese de explicar bien el procedimiento a segir, recalcándole al estudiante que debe manejar efectivamente el tiempo.   Se debe tener disponibles los recursos de computadora para que el estudiante pueda visualizar cómo trabajan las enzimas y entiendan los conceptos.  Se debe las gráficas de actividad enzimática.  Se debe discutir qué se espera del informe escrito que deben realizar y aprovechar  y repasar conceptos del método científico.  Vocabulario que deben conocer al finalizar el laboratorio:  Enzima, catalizador, substrato, producto, sitio activo, complejo enzima-substrato, activadores, cofactores, coenzimas, inhibidores competitivos y no competitivos.   Además, se debe repasar el modelo de las membranas biológicas y sus componentes principales.

 

Experimentos:

Parte 1:  Enzimas

Ejercicio 3 – Influencia de concentración y temperatura en la actividad de amilasa.  Estos ejercicios se harán por mesa.

Experimento 1:  El instructor hará este ejercicio a manera de demonstración.  Sólo se hará si Hector puede preparar las soluciones.

 

  1. Rotular 4 tubos de ensayo 1-4.  
  2. Preparar las siguientes diluciones:

Tubo 1: Dilución 50% almidón

Tubo 2: Dilución 25% almidón.

Tubo 3: Dilución 10% almidón.

Tubo 4: Dilución 5% almidón.

  1. Añadir 1 ml de solución de amilasa al tubo 1.  Mezclar circularmente.
  2. Añadir 1-2 gotas de yodo a cada compartimento de 4 filas de la placa de pruebas.
  3. Remover rápidamente 1 gota (T= 0) y añadir a uno de los compartimentos y observar.   Repetir en intérvalos de 30 segundos hasta que el color azul no se produzca.
  4. Repetir con los demás tubos. 
  5. Grafique sus resultados.

 

*A altas concentraciones de substrato aumentará el tiempo requerido para la enzima para completar la hidrólisis del substrato.  Por lo cual se espera el proceso ocurra más rápido en la solución de menor cantidad de almidón.

 

Experimento C:

 

  1. Rotular 4 tubos de ensayo.  Añadir 5 ml de solución de almidón a cada uno.
  2. Colocar los tubos en el siguiente orden:

1 = 80° C

2 = 37° C

3 = temp. ambiente

4 = 4° C

  1. Rotular 4 tubos más (1a, 2a…) y añadir 1 ml de la solución de amilasa a cada tubo y colocar en el mismo orden del no. 4.  Dejar todos los tubos ahí por 10 min.
  2. Añadir 1-2 gotas de yodo a cada compartimento de varias filas de la placa de pruebas.
  3. Mezcle los contenidos de los tubos 1 y 1a, tome el tiempo y remueva rápidamente 1 gota y añadir a uno de los compartimentos y observar resultados.
  4. Repetir en intérvalos de 30 segundos hasta que el color azul no se produzca, no más allá de 10 minutos en total.
  5. Repetir con los demás tubos.
  6. Grafique sus resultados (tiempo de reacción vs. temp):

80 grados: denaturalizada, color azul.

37 grados, pocos segundos o inmediatamente

temp ambiente: 2 a 3 minutos para completar la hidrólisis

4 grados: de 4 a 5 minutos

 

Parte 2: Membranas biológicas

Experimento A:  Efecto de la temperatura en las membranas:

 

  1. Cortar 6 pedazos de remolacha de 15 mm y colocar en tubos de ensayo
  2. Colocar el tubo 6 en el congelador por 30 min con 5 ml de agua
  3. Colocar el tubo 5 en el baño de hielo por 30 min con 5 ml de agua
  4. Colocar el tubo 1 en baño de agua caliente a 70 grados por 1 minuto, añadir al tubo 5 ml de agua.  Después de 20 minutos sacar el pedazo de remolacha y botar.
  5. Dejar que la temperatura baje a 55 grados y hacer lo mismo con tubo 2.
  6. Repetir el procedimiento de arriba con tubo 3 a 40 grados y con tubo 4 a 20 grados.
  7. Comparar intensidad de color al final del experimento.
  8. Graficar resultados (intensidad de color vs. temp):

Los resultados pueden variar pero se esperaría mayor intensidad en 70 grados, seguido por 55 grados, luego 40 y –5 grados (congelador) y menor intensidad en nevera y 20 grados.

 

 

Experimento B: Efecto de solventes en las membranas:

 

 

  1. En 6 tubos de ensayo colocar 6 pedazos de remolacha de 15 mm.
  2. Añadir 5 ml de las siguientes soluciones en este orden: metanol 1%, 25% y 50% y Acetona al 1%, 25% y 50%.
  3. Luego de 30 minutos remover la remolacha y observar.
  4. Mezclar en un tubo agua y acetona y observar resultados.
  5. Mezclar en otro tubo agua y metanol y observar resultados
  6. Mezclar en un tubo aceite y acetona y observar resultados
  7. Mezclar en otro tubo aceite y metanol y observar resultados
  8. Mezclar un poco de clara de huevo con metanol y con acetona y observar resultados

Resultados: de menor intensidad a mayor intensidad:

Metanol 1%, acetona 1%, metanol 25%, acetona 25%, metanol 50%, acetona 50%

 

 

Manejo del tiempo:

 

  1. Introducción – 10 min
  2. Parte 1: Experimento A - 40 min
  3. Experimento 1C - 30 min
  4. Parte 2: Experimento A – 40 min
  5. Experimento 2B – (empezar mientras se realiza el 2A y presentar resultados luego) – 25 min
  6. Discusión y prueba corta – 20 min
  7. Recoger el lab – 5 min

 

Materiales para el laboratorio 6:

 

Parte 1:

Experimento A (por mesa):

  1. Rejilla y 8 tubos de ensayo
  2. Lápiz de cera
  3. Plato de pruebas
  4. probeta
  5. 2 pipetas de 1 ml
  6. pipeta de 5 ml
  7. pipetas desechables
  8. bulbo para pipetas
  9. botellas con solución de yodo

 

Por laboratorio:  agua destilada, solución buffer a pH de 6.8, solución de almidón al 1%, solución de amilasa al 0.5%

 

Experimento C (por mesa):

  1. Rejilla y 8 tubos de ensayo
  2. Lápiz de cera
  3. Plato de pruebas
  4. probeta
  5. pipetas de 5 ml y 1 ml
  6. pipetas desechables
  7. bulbo para pipetas
  8. botellas con solución de yodo

 

Por laboratorio:  agua destilada, baño de agua a 80° C, baño de agua a 37° C, solución de almidón al 1%, solución de amilasa al 1%, beaker con hielo.

 

Parte 2:

Experimento A (por mesa):

  1. Gradilla
  2. 2 vasos de 150 a 200 ml
  3. 1 remolacha
  4. 6 tubos de ensayo
  5. Vaso con hielo
  6. Navaja
  7. Agarradera de tubo de ensayo
  8. Plato para calentar
  9. Aguja de disección
  10. Probetas o pipetas de 5 ml

 

En mesa de instructor:

  1. Sacabocados
  2. Termómetros
  3. Reglas
  4. Marcadores de cera
  5. Envase con hielo

 

Experimento B (en mesa de instructor):

  1. Rejilla con tubos de ensayo
  2. Soluciones de acetona y metanol
  3. 1 huevo
  4. aceite

 

Materiales del almacén: 

  1. Soluciones de metanol 1%, 25% y 50% y Acetona al 1%, 25% y 50% (75 ml de c/u dividido en dos botellas)
  2. 20 huevos
  3. aceite
  4. 30 remolachas grandes
  5. Solución buffer a pH de 6.8
  6. Solución de almidón al 1%
  7. Solución de amilasa al 0.5%
  8. Solución de amilasa al 1%