LABORATORIO DE INMUNOLOGIA

 

 

Ejercicio:  Determinación de la concentración de proteínas de la preparación de IgG

 

Para el análisis de la preparación de inmunoglobulinas es necesario saber su concentración de proteínas. 

Utilizaremos  el método del Ácido Bicinchonínico (BCA). Este método depende principalmente de que, en un medio alcalino, los enlaces peptídicos de las proteínas reducen Cu++. Los iones Cu+ producidos, se unen a dos moléculas de BCA y al hacerlo, les cambian la estructura electrónica  de tal manera que ahora absorbe luz a 562 nm y aparecen púrpura. En las condiciones de la reacción, la absorción del compuesto es proporcional a la concentración de proteína presente.

Para establecer la relación entre una cierta concentración de proteína y una cierta absorción, se prepara una serie de muestras estándares de proteína que tienen concentración conocida, se lleva a cabo la reacción y se determina, en un espectrofotómetro, la absorción de cada muestra. Se acostumbra hacer una gráfica con estos valores. En el eje de las X se localizan la concentración en  µg/ml  y en el de las Y, la absorción, en unidades de absorción. Allí se localizan los puntos que corresponden a una determinada concentración y su respectiva absorción. La  línea sugerida por los puntos de los estándares indica la relación entre proteína concentración y absorción.

Paralelamente se lleva a cabo la reacción con las muestras experimentales.  En la gráfica se puede leer entonces a qué concentración de proteína corresponde la absorción producida por estas muestras.

 

 

Preparación del Reactivo de Trabajo

 

Mezcle:  10 mls. del Reactivo A (BCA, en condiciones alcalinas) con

         0.2 mls. del Reactivo B (4% de Sulfato de Cobre)

      

Preparación de la serie de estándares.

 

A partir de una solución comercial de 2000 µg/ml  de albúmina sérica bovina (BSA) prepare 8 microtubos que contengan:    1200, 1000, 800, 600, 400, 200, 100 y 0 µg/ml.

Para preparar 1 ml de:

               1200       mezcle    600 ul  de la solución de BSA   y        400 ul  de diluyente (PBS)

               1000                     500                                             500

                 800                     400                                             600

                 600                     300                                             700

                 400                     200                                             800

                 200                     100                                             900

                 100                       50                                             950

                     0                         0                                            1000

 

Transfiera 10 ul de ‘1200’ a cada una de las fosas A1, A2 y A3

Transfiera 10 ul de ‘1000’ a cada una de las fosas B1, B2 y B3

Transfiera 10 ul de ‘800’ a cada una de las fosas C1, C2 y C3.

Continue hasta transferir  10 ul de ‘0’ a cada una de las fosas H1, H2 y H3

 

 

 

 

 

       Preparación de las muestras experimentales.

              

               Como es posible que la concentración de IgG en la preparación obtenida de la columna esté por encima de los estándares debemos hacer diluciones de esta muestra para asegurarnos que  su absorción quede dentro de la curva.

 

               Preparaciones de IgG.

 

               Tome 20 ul de la prepración de IgG , añádalos a 80 ul de PBS. Marque el microtubo “1:5”     Tome 10 ul de la prepración de IgG , añádalos a 90 ul de PBS. Marque el microtubo “1:10”

 

               Transfiera 10 ul  de estas muestras experimentales a la placa de microensayos asi:

               De la dilución 1:10  a las fosas B5, B6 y B7

               De la dilución 1:5  a las fosas C5, C6 y C7.

               De la preparación original a las fosas D5, D6 y D7.

 

       Ensayo

 

1.      Añada 200 ul del  Reactivo de Trabajo a cada una de las fosas con estándares o muestras.

 

2.      Agite la placa cuidadosamente por unos 30 segundos para asegurar la mezcla  de las proteínas con los reactivos.

 

3.      Cubra la placa y manténgala a 37º C por 30 minutos.

 

4.      Lea la absorción a 562 nm en el espectrofotómetro provisto.

 

5.      Haga una gráfica de la relación entre proteína concentración y absorción utilizando el promedio de los tres valores encontrados para cada concentración.

 

6.      Utilizando el promedio de las lecturas para la preparación de IgG, halle su concentración en la gráfica. Si la absorción de la preparación original no queda dentro de la curva, utilice la lectura de una de las diluciones y multiplique por 5 o por 10, según la dilución usada, para saber la concentración de la preparación original. Anote este valor, la concentración de proteína de la preparación de IgG, que se usará en el próximo laboratorio.