INMUNOLOGIA

 

Laboratorio:  Inmunodifusión doble

(Análisis de las fracciones cromatográficas)

 

     Gracias a que las moléculas de inmunoglobulina tienen por lo menos dos sitios para unirse con el antígeno, es decir son por lo menos divalentes; a que normalmente son policlonales y a que las moléculas de antígeno tienen generalmente más de un determinante antigénico, el encuentro entre las dos poblaciones, la de antígenos y la de sus inmunoglobulinas específicas, resulta en la formación de una red tridimensional entre ellas. Esta red o complejo, Ag-Ig, facilita fagocitosis del antígeno in vivo; y, siendo lo suficientemente grande para ser visible, se utiliza in vitro para demostrar la presencia de antígenos específicos para una Ig de especificidad determinada. Diversas técnicas tales como, inmunodifusión radial, inmunoelectroforesis e inmunodifusión doble utilizan la formación de complejos Ag-Ig para detectar antígenos. En este ejercicio haremos inmunodifusión doble.

 

      En esta técnica se prepara un gel de agarosa, en el cual se colocan, a una distancia de varios mm una de otra, las dos poblaciones. Tanto las inmunoglobulinas como los antígenos migran por difusión y en minutos, o pocas horas, se encuentran. Si hay especificidad entre ellas y están presentes en las concentraciones apropiadas se forma en pocas horas, el complejo Ag-Ig que es visible como una línea blanca. Esta línea se forma en el frente del encuentro de las dos poblaciones y es por lo tanto perpendicular a la dirección de migración entre ellas. Generalmente se quiere  comparar la presencia de antígeno en diversas muestras, entonces las diversas muestras se colocan a distancias equidistantes de la preparación de Ig. Si dos preparaciones colocadas en la vecindad una de otra contienen el antígeno sus líneas de complejo Ag-Ig, también llamadas líneas de precipitación, se fusionan y aparecen como un arco contínuo.

 

 

      Preparación del gel de agarosa

 

·      Disuelva 1 g de agarosa en 100 ml de amortiguador de barbital a pH 8.6; caliente y agite hasta cuando la agarosa entre en solución.

·      Marque dos laminillas en el extremo esmerilado para que puedan ser identificadas y orientadas luego.

·      Con un pipeteador de 1ml, vierta 3 ml de agarosa caliente, a más de 60 °C, sobre cada una de las laminillas. Cuide que no se desborde.   Deje que la agarosa se enfríe y polimerice.

·      Con un perforador perfore fositas para las muestras: una fosita central para las Igs y seis fositas equidistantes para los antígenos, separadas unos 7mm. Haga dos hexágonos en una laminilla y uno en la otra. No los haga sobre el área esmerilada de la laminilla. Puede seguir el siguiente patrón:

 


     

Preparación de las muestras  

 

      Igs Específicas:

            A.   anti-IgG humana

            B.   anti-IgM humana

            C.   anti-albúmina humana.

      (Diluidas 1:4 en amortiguador de barbital)

 

 

      Antígenos:

      1.   Su fracción con IgG

      2.   Su fracción con IgG, diluida 1:5 en amortiguador de barbital.

      3.   Su fraccion de 'lavado' de la columna de afinidad.

      4.  Su fraccion de 'lavado' de la columna de afinidad, diluida 1:5 en amortiguador de barbital.

      5.   Plasma diluido 1: 10 en amortiguador de barbita.

      6.   Plasma diluido 1: 50 en amortiguador de barbital.

 

Aplicación de las muestras

 

·      Coloque en las fositas de los antígenos 5 ml de cada una de las seis preparaciones en el orden mostrado en la gráfica. Repita para los tres hexágonos, A, B y C.

 

·      Coloque en las fositas centrales de los tres hexágonos 5 ml de los respectivos antisueros.

 

 

Mantenga las laminillas en una cámara humeda a temperatura ambiente de un día para otro

 

      Lectura de los resultados

 

Iluminando lateralmente, observe las líneas de precipitación en los lugares donde hay correspondencia entre antísuero y antiígeno.

 

Indique si el experimento confirma que su preparación contiene IgG.

Indique si su muestra de ‘lavado’ contienen Ig M o albúmina.

Indique si su preparación de IgG está libre de albúmina y de Ig M.