BIOL 3010L

Ejercicio #7

Electroforesis de Amilasas

 

 

Introducción:

 

Los fragmentos de moléculas de DNA son, por lo general lineales, con una carga negativa, que les permite migrar durante una electroforesis hacia el polo positivo. La razón de migración depende básicamente de su tamaño.

Las proteínas, en cambio pueden presentar cadenas de aminoácidos que pueden ser positivas, negativas o neutrales. Estas diferencias dependen de la composición de aminoácidos, y la distribución de los mismos pueden incluso alterar la forma de la proteína. La composición del amortiguador en el que se corre la electroforesis y su pH puede también afectar la carga neta de la proteína y por lo tanto su razón de migración en el gel.

Para que las proteínas corran de forma más uniforme, usualmente son tratadas con un detergente, dodecilsulfato de sodio (SDS). Este es un detergente aniónico fuerte que rodea las proteínas con una cubierta de cargas negativas. En adición, el SDS desnaturaliza las proteínas, permitiéndoles asumir una forma más lineal y uniforme. El amortiguador de muestra con que se corre las proteínas puede tener un agente reductor aún más fuerte, como el mercaptoetanol, que rompe los puentes disulfuro desnaturalizando la proteína aún más. Las proteínas con SDS corren hacia el electrodo positivo de un campo eléctrico, y la distancia que migran es proporcional a su peso molecular.

El SDS es útil en la electroforesis pero es detrimental a las proteínas. Al desnaturalizarlas, las enzimas pierden actividad. O sea, no pueden realizar la reacción enzimática que se supone que catalicen. En este experimento usaremos el SDS para linealizar un poco la enzima que estudiaremos, amilasa, pero como también determinaremos la presencia de la enzima basados en su actividad, debemos remover el SDS para recuperar su actividad. Esto se logra remojando el gel en Tritón X-100, un detergente suave no iónico que sustituye al SDS en las proteínas, y luego sacando el Tritón remojando en agua toda la noche. Se supone que una buena parte de la actividad sea recuperada y lo podamos ver en el gel.

Otra cosa que usualmente se hace al correr geles con proteínas es hervir la muestra. Pero esto también afecta la actividad. Aunque la muestra de saliva que usaremos corre mejor si se calienta a 70 ˚C por 2 a 3 minutos, se pierde parte de la actividad enzimática; por lo que no la calentaremos.

Podemos estimar el peso molecular de una proteína corrida en electroforesis con ayuda de una curva estandar de razón de migración. Para ello se corre junto con las muestras experimentales una mezcla de proteínas de peso conocido, tratadas de forma similar. Estas muestras tienen un tinte que por su poco peso molecular migra más fácilmente por lo que se desplazan más en el gel. Este tinte marca el frente de la muestra y es por este que nos dejaremos llevar para saber hasta qué punto debemos correr la electroforesis. Midiendo luego de la corrida la distancia viajada por el tinte y las muestras, podemos comparar la razón de migración de los estándares con la de los experimentales y determinar el tamaño aproximado de estos.

 

 

objetivos:

 

            Definir desnaturalización de proteínas, viendo el efecto de agentes desnaturalizantes en una muestra de proteínas biológicamente activas.

            Practicar la preparación de geles horizontales y a la vez aprender a teñir proteínas en un gel.

            Practicar métodos para identificar una enzima específica en una mezcla de proteínas, usando reacciones enzimáticas.

           

 

Materiales:

 

Para un gel grande:

Agarosa para proteínas, 3.0 g

Agua destilada

Amortiguador de corrida Tris-glicina con poco SDS

Almidón, 0.5 g

Tinte Coomasie para proteínas, 50 ml por gel

Solución desteñidora, 100 ml por gel

Tritón X-100 al 5%, 50 ml por gel

Amortiguador de muestra con poco SDS

Equipo de electroforesis

Micropipetas y puntas

Pipetas de 1 ml

Tubos de microcentrífuga

Habichuelas secas, remojadas desde la noche anterior (5 ml agua /gramo de habichuela)

Baño a 70˚

Regla plástica o cuchilla para cortar el gel

Estandar de proteínas de tamaño conocido.

 

O en su lugar se puede usar el kit para electroforesis de amilasa en minigeles, que provee Carolina Biological.

Este kit viene con amilasa purificada, que se puede usar como control positivo

 

 

Procedimiento:

 

A.     Preparación del gel: Puede hacerse por anticipado.

1.      Echar 3.0 g de agarosa en 80 ml de agua por cada gel a preparar y mezclar bien.

2.      Echar 0.5 g almidón en 20 ml amortiguador de corrida Tris/glicina/SDS 5X, mezclar bien, hasta que no queden grumos.

3.      Unir ambas soluciones, mezclar bien y hervir en baño de agua caliente por 15 minutos. Dejar en el agua caliente hasta que este listo de vertir. Mientras tanto, desgasificar el gel.

4.      O si se usa el kit, derretir la gelatina en baño María a 70˚C hasta que fluya con facilidad.

5.      Preparar el molde, que debe estar bien limpio, y vertir el gel.

6.      Dejar solidificando y cuando esté listo, se cubre con papel elástico hasta que se vaya a usar. No guardar en el amortiguador.

B.     Preparación de muestras.

1.      Saliva humana:

a.       Tomar un volumen de saliva y diluir en dos de agua destilada. Si sigue muy espesa, tomar un volumen del diluído y echar un volumen adicional de agua.

b.      Tomar 36 μl de saliva diluída y echarle 12 μl de tinte de carga (loading dye).

2.      Habichuela:

a.       Macerar las habichuelas en el agua de remojo hasta hacer una pasta.

b.      Añadir más agua si es necesario, para facilitar el manejo.

c.       Combinar  36 μl de la pasta con 12 μl de tinte de carga

3.      Amilasa pura:

a.       Combinar 36 μl de amilasa con 12 μl de tinte de carga

 

C.     Electroforesis:

1.      Echar 20 μl de las muestras en patrones repetitivos, de forma que al final podamos dividir el gel en dos mitades, cada una con la misma secuencia de muestras. Ver el patrón en el diagrama a continuación.

 

       A       B       C       D        A       B       C       D

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.      En las fosas A echar 20 μl de amilasa pura

3.      En las fosas B echar 20 μl de saliva o de habichuela, para un grupo. Hacer lo mismo para las fosas C.

4.      Si se tiene disponible, usar un estandar en la fosa D, para determinar el tamaño de las bandas observadas.

5.      Correr por 45 minutos a 130V.

6.      Remover el gel de la cámara y cortar por la mitad, siguiendo la línea entrecortada.

D.    Tinción y reactividad:

1.      Reactividad de la enzima:

a.      Echar una mitad del gel en Tritón X-100 al 5% y dejar por 15 minutos a 2 horas.

b.      Enjuagar con agua destilada, descartando el agua con el jabón.

c.       Incubar a 37˚C o a temperatura ambiente hasta el otro día.

2.      Tinción de proteínas:

a.       A la otra mitad, echar azul  de Coomasie y dejarlo por un minuto.

b.      Enjuagar el tinte con agua destilada y echar solución desteñidora.

c.       Dejar hasta el otro día, si es posible, cambiando la solución desteñidora por lo menos una vez.

 

 

observaciones y Resultados:

 

1.      Comparar el patrón de bandas del segmento teñido en azul de Coomasie con las zonas claras en la parte que no se tiñó.

2.      ¿Cuántas bandas de proteínas se separaron en el gel? (Ver parte teñida con azul de Coomasie)

 

3.      ¿Cuáles de las bandas corresponden con las de amilasa? (Ver zonas más claras en el segmento lavado en Tritón.). Para poder verlas hay que levantar con cuidado el gel y mirar a contra luz.

 

4.      ¿Como determina la actividad de la enzima?

 

5.      Prepare una curva estándar para calcular tamaños. Vea cálculos abajo. ¿Qué tamaño aproximado presentan las amilasas?

 

6.      Entre las cosas que incluya en la discusión, compare el estándar de proteínas y las bandas correspondientes a las de amilasa.

 

 

CALCULOS:

 

1.      Medir la distancia recorrida por el tinte del frente de muestra, desde la base de la fosa (dt).

 

2.      Medir la distancia recorrida por cada banda del estándar (de).

 

3.      Dividir dt/de para obtener la razón de migración de cada estándar (Rf).

 

4.      Calcular el logaritmo del peso molecular de cada estándar (log PM).

 

5.      Graficar log PM vs Rf:

 

 

 

 

6.      Tirar una línea de regresión.

 

7.      Calcular el Rf de cada banda de proteína de amilasa.

 

8.      Extrapolar el valor de Rf de los experimentales hasta la línea de la gráfica y buscar el logaritmo inverso al valor correspondiente en el eje de y, para determinar el peso molecular.