BIOL 3010L

Ejercicio #11

Análisis de Enzimas de Restricción

Introducción

Parte 1. Biología Molecular

Una de las técnicas más modernas de la biotecnología es la manipulación del DNA: cortar DNA y unirlo a otras moleculas de DNA. El concepto básico es remover un fragmento funcional de DNA, por ejemplo un gen, del cromosoma de un organismo y combinarlo con el DNA de otro organismo para poder estudiar cómo funcionan los genes. Por ejemplo, a algunas plantas se les ponen genes de resistencia para las infecciones o enfermedades. Se le pueden poner genes funcionales a personas que tengan genes no funcionales o mutados, como pasa con el caso de fibrosis cística.

En este laboratorio el DNA que se utiliza es el genoma completo de un virus bacterial que ha sido cortado en pedazos por enzimas. De los fragmentos de DNA que se producen, imagine que una pieza representa un gen específico. Este gen podría codificar para cualquier tipo de característica, pero antes de que se le dé a un organismo, primero hay que identificar qué gen es por medio de electroforesis de gel.

Se le proveerá un cantidad de DNA y tres enzimas de restricción. El analisis de restricción de DNA que se hará es fundamental para técnicas de ingeniería genética, las cuales incluyen cortar genes, secuenciación de DNA, localización de genes, apareamineto forense del DNA, y DNA fingerprinting. Antes de empezar, deben repasar la estructura del DNA y la actividad de las enzimas de restricción.

Parte 2. La estructura del DNA

El DNA consiste de una serie de moléculas de bases nitrogenadas que se mantienen unidas por enlazes de hidrógeno débiles. Estos pares de bases luego se unen a un "esqueleto" de azucares y fosfato. Las cuatro bases son adenina, timina, guanina y citosina (A, T, G, C). Ver la figura para repasar la estructura del DNA. Recordar que el apareamiento de bases es A-T y C-G.

En esta representación del DNA los símbolos son los siguientes: Cadenas Laterales: S = Azúcar de 5 carbonos, deoxyribosa P = Molecula de fosfato compuesta de átomos de fosforo y oxygeno Bases: A = Adenina C = Citosina G = Guanosina T= Timina

Parte 3: Enzimas de restricción - Tijeras moleculares

Los virus bacteriofagos son los mayores enemigos de las bacterias. Estos virus infectan a la bacteria inyectando su propio DNA y obligando a la bacteria a multiplicar el DNA viral. Las bacterias han respondido a través de la evolución de las defensas naturales, con enzimas de restricción, las cuales cortan y destruyen el DNA invasor. Estas enzimas buscan en el DNA viral una secuencia palindrómica específica de pares de bases y cortan el DNA en pedazos en estos lugares. El lugar actual del palíndrome donde se corta el DNA es llamado sitio de restricción.

Una característica importante de las enzimas de restricción es que cada enzima reconoce un palíndrome específico y solo corta el DNA en ese lugar específico. Un palíndrome puede ser repetido un numero indeterminado de veces en un filamento de DNA y las enzimas de restricción cortarán todos los palíndromes en su sitio de restricción.

Parte 4: Electroforesis de gel de Agarosa

La electroforesis de gel de agarosa es un procedimiento que se utiliza para separar los fragmentos de DNA basado en sus tamaño. El DNA es una molecula que contiene muchas cargas electricas negativas. Los científicos han usado este hecho para diseñar un método que puede ser utlizado para separar piezas del DNA.

Una solución que tenga una mezcla de fragmentos de DNA es colocado en una fosa pequeña en un gel horizontal de agarosa, el cual tiene una consistencia similar a la gelatina. Cualquier corriente eléctrica causaría que el DNA, negativamente cargado, se mueva hacia el electrodo positivo.

Imagine el gel como un coladero, con muchos poros, que permiten que las particulas pequeñas se muevan a través de este rápidamente, mientras que las partículas de mayor tamaño se mueven lentamente. Luego de un periodo de tiempo expuesto a la electricidad, los fragmentos de DNA se separan a través del gel de agarosa por tamaño. Los fragmentos que son del mismo tamaño se moveran juntos a través de la gel y forman bandas.

Objetivos:

Durante el procedimiento haremos lo siguiente:

· Cortar el DNA lambda en una serie de fragmentos utililzando las enzimas de restricción.

· Cortas a su vez un poco de DNA genómico aislado la semana anterior.

· Separar un grupo grande de moléculas de DNA por su tamaño utilizando electroforesis en gel de agarosa.

· Determinar el tamaño de cada banda de fago lambda cortada con las distintas enzimas, comparando con un marcador estandar.

Su tarea será determinar el tamaño de las piezas del DNA a través de la electroforesis de gel. Esto envuelve separar una mezcla de las moleculas por el tamaño de las piezas y comparar con DNA de tamaño conocido. En adición usaremos parte de DNA que logramos aislar durante el laboratorio pasado.

Materiales:

Kit de BIO-RAD : Digestión enzimática y análisis de DNA de Lambda.

Equipo de electroforesis horizontal

DNA genómico aislado previamente

Procedimiento

Parte I: Digestión

El DNA que se le proveerá ha sido extraído de un bacteriofago - un virus que invade bacterias. Se conoce como Lambda (l). Estarán trabajando con tres enzimas de restricción, tambien conocidas como endonucleasas. Estas son: PstI, EcoRI y HindIII.

Preparación de enzimas de restricción:

1. Escoja cuatro microtubos de colores distintos, nómbrelos L, P, E y H y póngalos en el rack the foam de microtubos.

L, tubo amarillo = Sin enzima de restricción - DNA lambda sin cortar

P, tubo violeta = DNA lambda digerido por PstI

E, tubo verde = DNA lambda digerido por EcoRI

H, anaranjado = DNA lambda digerido por HindIII

2. Usted preparará sus reacciones de digestion en tubos pequeños. A cada tubo añada 4 ml de el DNA lambda sin cortar, 5 ml del buffer de restricción y 1 ml de la enzima. Añada solo un tipo de enzima a cada tubo.

Importante: Primero añada el DNA, luego el buffer y finalmente las enzimas a los tubos. Utilizar una punta de pipeta nueva cada vez que vaya a servir buffer, si la punta entra en contacto con el DAN que ha sido servido previamente. Usar una punta distinta para cada una de las enzimas.

Seguir la siguiente tabla:

Tubo	DNA Lambda	Buffer de restricción	PstI	EcoRI	HindIII
P	4ml	5ml	1ml	-	-
E	4ml	5ml	-	1ml	-
H	4ml	5ml	-	-	1ml
L	4ml	4ml	-	-	-

· ¿En que tubo usted espera que no se produzcan fragmentos de DNA?

· ¿Que falta en ese tubo?

3. Ajuste la tapa en cada tubo. Aguante la parte superior del microtubo con el índice y el pulgar de una mano, y golpee suavemente la parte inferior del tubo con el dedo índice de la otra mano. Suavemente golpee la parte inferior del tubo contra la mesa para recolectar el líquido. Si está usando una microcentrífuga , asegúrese de que esta esté balanceada . Haga un "pulse-spin" (aguantar el botón de encendido por unos segundos). Este paso hace que las soluciones bajen al fondo del tubo y se mezclen.

4. Ponga las muestras en tubos a 37°C en un baño de agua por 30 minutos o déjelos incubar a temperatura ambiente de un día a otro. Las enzimas de restricción funcionan mejor a 37°C ya que han sido aisladas de bacterias que viven dentro de un organismo de sangre caliente. NOTA: Mientras espera, debería utilizar el tiempo para preparar el gel de agarosa.

Parte II: Electroforesis

El DNA es incoloro por lo tanto los fragmentos de DNA no se pueden ver durante la electroforesis. Un "loading buffer" azul, el cual contiene 2 tintes azules, se le añade a la solución del DNA. El loading dye no mancha el DNA pero hace que se facilite depositar el DNA a las fosas y ayuda a monitorear el movimiento del DNA en la gel. El tinte migra hacia el polo positivo al igual que los fragmentos del DNA. El tinte "rápido" migra con los fragmentos del DNA de tamaño 500bp mientras que el tinte "lento" migra con los fragmentos del DNA de tamaño de 5,000 bp.

1. Luego de incubar, tome los microtubos L, P, E y H y póngalos en el rack.

2. Transfiera 2.0ml de loading dye a cada tubo. Use una punta nueva para cada uno para evitar contaminación de la muestra.

3. Asegúrese de que el tinte y el DNA estén bien mezclados antes de depositarlo en las fosas de la gel. Puede utilizar una microcentrifuga y hacer "pulse spin".

4. Obtenga un gel de agarosa pre-hecho o prepare uno.

5. Ponga la gel en la plataforma.

6. Asegurese que las fosas estén en el cátodo o lado negativo (electrodo negro).

7. Cuidadosamente remueva el peine, hacia arriba.

8. Deposite aproximadamente unos 275 mL del buffer de electroforesis en la camara de electroforesis, debe ser suficiente como para cubrir las fosas sobre 1-2 mm.

9. Pipetée 10 ml de cada tubo en fosas distintas.

10. Cubra la cámara de electroforesis y conéctela.

11. Deje que ocurra la electroforesis por 30 - 40 minutos a 100V. Observe cómo se mueve el loading dye.

12. Cuando termine la electroforesis apague la fuente de electricidad y desconecte.

13. Remueva la tapa de la cámara

14. Remueva la bandeja del gel delicadamente.

15. Remueva el exceso de buffer para reusar.

Parte III: Tinción del gel

1. Cuidadosamente deslize la gel en la bandeja para teñir. Asegúrese de poner sus iniciales en la bandeja.

2. Añada la solución para teñir el DNA hasta que cubra la gel. Aproximadamente unos 60 mL. Cubra la bandeja. Permita que la gel se empape en la solución si es posible de una noche a otra.

3. Al otro día, vierta la solución que se encuentra en la bandeja en un envase ya que se puede reciclar.

4. Para deteñir la gel enjuage varias veces con agua.

5. Llene la bandeja de teñir con suficiente agua para cubrir la gel. Dejarla por unos 10-20 min.

6. Remueva el agua en exceso. Examine los patrones de DNA en cada linea. El contraste se puede ver mejor si se permite que la gel se quede en agua de un dia a otro. Las bandas de DNA se verán como líneas azules contra un fondo claro.

7. Ponga la gel en un fondo claro, como una lámpara transiluminadora. Haga un registro de sus resultados, poniendo papel transparente sobre la gel y marcando con marcador permanente los patrones para así poder analizar los resultados.

Resultados:

1. Medir la distancia en mm que cada fragmento de DNA viajó. Usar la copia que hizo con el papel plástico y el marcador. Para ello, medir con una regla la distancia que hay desde el fondo de la fosa hasta la ralla que marca la posición de la banda. Hacer la medida en milímetros. Anotar en la tabla que sigue a continuación.

2. Utilizando los tamaños dados para los fragmentos estándares, estimar el tamaño, en pares de base para cada fragmento. Comparar la distancia viajada por los desconocidos con los estandares. Estime el tamaño de las bandas obtenidas y anote en la tabla.

3. Construir una curva estandar para estimar el tamaño aproximado de los fragmentos de DNA digerido. Anote el tamaño calculado con la curva en la tabla, debajo de los tamaños estimados.

4. Para hacer la curva estandar, se usa papel de gráfica logarítmico (ver ejemplo al final). En el eje de Y van los tamaños en pares de bases. En el eje de X van las distancias que migraron las bandea en milímetros. Se ubican los puntos correspondientes al marcador estándar, el cual es fago Lambda cortado con la enzima HindIII. Los tanaños de los fragmentos de DNA obtenidos aparecen en la tabla bajo la columna M. Tirar una línea recta que se acerque lo más posible a los puntos obtenidos. Si hay algún punto que se desvíe demasiado de la línea, no lo incluya en ella. Esa será la línea estándar. Para determinar el tamaño de los otros fragmentos, busque el punto que indique la distancia que viajó su muestra. Marque ese puntro en X y busque el punto de intersección en la línea de la gráfica. Busque la coordenada correspondiente en el eje Y. Ese será el tamaño en pares de bases de sus fragmentos. Haga el análisis para todos los fragmentos que obtuvo.

Bandas de mayor a menor	M= DNA marker		L = DNA lambda Sin enzima		P = Pstl digerido de restricción de DNA de Lamda		E= EcoRI digerido de restricción de DNA de Lamda		H = HindIII digerido de restricción de DNA de LAmda
	Distancia en mm	Pares de bases	Distancia en mm	Pares de bases	Distancia en mm	Pares de bases	Distancia en mm	Pares de bases	Distancia en mm	Pares de bases
#1		23,130
#2		9,416
#3		6,557
#4		4,361
#5		2,322
#6		2,027

Análisis de la Data y Discusión

Estudie detenidamente la seguiente secuencia y conteste las preguntas que siguen.

1. Si se hace un diagrama de un segmento del DNA sin las azucares y los fosfatos, las secuencia de las bases sería:

Mire a la secuencia linear de las bases en cada hebra.

· Describa cualquier patrón que vea en la secuencia de bases superior

· Compare las bases en la porción superior de la molécula con las que se encuentran en la porción inferior. Describa cualquier relación que encuentre.

· Mire la secuencia superior y compare con la secuencia inferior. ¿Nota algún agrupamiento de las bases que cuando se leen de izquierda derecha y de derecha a izquierda se leen exactamente en el mismo orden?

2. Si el palíndrome GAATTC es repetido cuatro veces en la misma pieza de DNA linear y la enzima de restricción reconoce que la secuencia de bases esta presente:

· ¿Cuantos fragmentos de DNA se producirán?

· Si el palíndrome GAATTC se repite y se encuentra separado al azar, ¿qué usted puede decir acerca del tamaño de los fragmentos que se producirán?

3.
Una pieza del DNA se corta en 4 fragmentos (ver diagrama). Una solución de los 4 fragmentos es depositada en una fosa en el gel de agarosa. Dibuje en el diagrama como usted cree que los fragmentos se puedan separar. Identifique cada fragmento.

· ¿Donde se encuentran los fragmentos con el mayor número de pares de bases, por que?

· Si ud tuviera 500 pedazos de cada fragmento, ¿Como se vería la gel?

· Si se pudieran pesar los fragmetos, ¿cuál sería el más pesado? ¿Por qué?

· A mayor tamaño el fragmento de DNA, …

El siguiente diagrama representa el DNA genómico del bacteriofago Lambda, señalando con las flechas dónde la enzima de restricción Hind III corta el DNA. Los números indican la cantidad de pares de bases en cada fragmento.

· ¿Cuantos fragmentos se producen por la enzima de restricción HindIII?

5. Analice la digestión enzimática:

· Compare el tubo P con el tubo L; ¿qué usted cree que le ocurrirá al tubo P en comparación con el tubo L?

· ¿Por qué usted espera esta diferiencia?

· ¿Si el DNA en el tubo L se fragmenta al final de la reacción, cual es su conc lusión?

· ¿Hay algún cambio visible en el DNA luego de añadir la enzima de restricción?

· ¿Cómo se vió el DNA genómico que se corrió en el gel junto con lambda?

· ¿Por qué se vió de esta forma?