BIOL 3010L

Ejercicio #6

Cinética de enzimas

INTRODUCCION:

Las enzimas son una clase especial de proteínas globulares con actividad catalítica específica. Por regla general, todas las reacciones bioquímicas están mediadas por enzimas. En una célula ocurren de 2000 a 3000 reacciones químicas distintas, por lo que teóricamente podría haber una cantidad similar de enzimas. Cada enzima actúa sobre una sustancia específica (sustrato) y lo convierte en un producto específico. Esto implica dos eventos: primero, que el sustrato debe adherirse a la enzima y segundo, que la enzima altera al sustrato para convertirlo en producto. El lugar en la enzima donde el sustrato es alterado se conoce como el sitio activo.

Las dos reacciones básicas que llevan un sustrato a un producto son:

En este esquema, k₁, k _-1 y k₂ son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que:

• v₁ = k₁ [E] [S]
• v_-1 = k_-1 [ES]
• v₂ = k₂ [ES]

Si [E_t] representa la concentración total de la enzima en una reacción y [ES] es la concentración del complejo enzima-sustrato, entonces [E_t] - [ES] representa la concentración de enzima libre para reaccionar con el sustrato. Durante una reacción enzimática, mientras haya enzima libre, esta se unirá al sustrato, hasta que todas las moléculas de enzima se saturen. Usualmente la concentración de sustrato [S] es mayor que [ES], por lo que el sustrato no resulta un factor limitante. La razón de formación de ES está definida por

ES Rate = k₁ ([E_t] – [ES]) [S]

Mientras que la disociación está definida por

ES disociation rate = k _–1 [ES] – k₂ [ES]

Mientras haya enzima disponible, la razón de k₁ (constante cinética de formacion de ES) irá aumentando hasta que las moléculas de enzima se saturen. Si las constantes de reacción y disociación son iguales, la formación del complejo ES se mantiene estable al igual que la velocidad de reacción. O sea que la generación del producto se mantiene constante mientras la concentración del sustato no sea limitante. Esto se definiría como

[ES] = k₂ [E_t] [S]

[S] + (k₂ + k _-1) / k₁

La velocidad inicial de la reacción está determinada por

v = k₂ [ES]

Si definimos K_M como (k₂ + k _-1) / k₁ y V_max como k₂ [E_t], obtenemos que

v = V_max [S] / K_M + [S]

K_M = constante de Michaelis Menten : Concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad de reacción máxima V_max

Esta es la ecuación de Michaelis Menten !!!

En un estudio de cinética de enzimas se mide la actividad enzimática en términos de producto formado por minuto, a distintas concentraciones de sustrato. Si la actividad es graficada en términos de la concentración inicial del sustrato versus el producto generado en un lapso de tiempo (velocidad de reacción), la curva generada es una hipérbole rectangular. La ecuación que describe todos los puntos en esa línea viene dada por v. Esta ecuación expresa la velocidad para la reacción de un solo sustrato catalizada enzimáticamente y se conoce como la ecuación de Michaelis-Menten:

V _max v = V_max [S] / (K_m + [S])

v

v = actividad enzimática

V _max/2 [S] = concentración de sustrato

K_M V_max = actividad a [S] infinito

K_M = el valor de [S] que da actividad

[S] igual a ½ V_max

Estos últimos dos parámetros son importantes, porque nos dan información directa sobre cuán bien la enzima se une al sustrato (K_M) y sobre cuán bien la enzima convierte el sustrato en producto una vez se une (V_max). De hecho, K_M es la constante de disociación dinámica de la enzima con el sustrato, y V_max es la concentración molar de la enzima por la constante catalítica (K_cat).

Determinar estos parámetros de una gráfica de v vs [S] es difícil porque es imposible medir v a [S] infinito. Sin embargo, hay un truco: la ecuación Lineweaver-Burk. Si calculamos el recíproco de la ecuación M-M quedaría rearreglada como sigue:

1/v = 1/V_max + K_m/V_max × 1/[S]

1/v

En una gráfica de 1/v vs 1/[S] esta ecuación K_m/V_max

describe una línea recta, donde 1/V_max es el 1/V_max

intercepto en el eje Y (o v a [S] infinito), y el

intercepto en X es –1/K_m.

-1/K_m 1/[S]

PROPOSITO:

En este ejercicio estudiaremos el comportamiento de una enzima, peroxidasa de rábano o HRP. Esta enzima remueve un par de electrones de un donante de electrones reducido y los pasa a peróxido de hidrógeno para formar agua. Los productos serán un donante de electrones oxidado y agua. El donante de electrones reducido es guayacol, el cual es incoloro. El donante oxidado que se produce en la reacción es tetraguayacol, que es marrón. El coeficiente de extinción de tetraguayacol (el producto) a 470 nm es 26,600/M cm.

MATERIALES:

Gradillas

Tubos de ensayo, siete

Agua destilada

Peróxido de hidrógeno, 3 mM

Guayacol, 3 mM

Peroxidasa de rábano (HRP), 1:2000

Pipetas de 1 ml o pipeteadores con puntas de 1 ml

Cuvetas de espectrofotómetro, 3 ml

Reloj con segundero o cronómetro

Espectrofotómetro

Kimwipes

Papel toalla

PROCEDIMIENTO:

1. Preparar una dilución en serie, de seis tubos, de peróxido de hidrógeno en factor de dos, a partir de una solución 3mM. Comenzar con 2 ml de 3 mM H₂O₂ en el tubo 1 y 1 ml de agua en los tubos 2 a 6. Sacar 1 ml de H₂O₂ del tubo 1 y mezclarlo con el agua del tubo 2. Sacar 1ml del tubo 2 y mezclarlo con el agua del tubo 3. Continuar la serie hasta el tubo 6. Este tendrá 2 ml de solución: descartar 1 ml. Preparar un control con agua. Al final debe tener siete tubos: seis con 1 ml de solución de H₂O₂ c/u, y uno con 1 ml de agua.

***Si desea, prepare la dilucion en serie directamente en las cuvetas de 3 ml. PERO debe asegurarse de que no las raye o que no le caiga sucio. Esto puede alterar sus lecturas.

2. Añadir a los siete tubos 1 ml guayacol.

3. Al control (tubo 7) añadir 1 ml de solución HRP y usar para blanquear el espectrofotómetro. Reservarlo para corregir el blanqueo, de ser necesario.

4. Eche la solución del tubo 1 en su cuveta y coloque dentro del espectrofotómeto. Añada 1 ml de HRP y tome la primera lectura en ese momento (Tiempo 0; vea tabla de datos). Tomar lecturas adicionales cada 15 segundos por tres minutos. Anotar en forma tabular.

5. Repetir pasos 3 y 4 para cada tubo. Al finalizar deberá tener una tabla con seis columnas de datos. Si hacen todo como debe ser, el proceso completo no les tomará más de 30 minutos.

6. Grafique los datos en formato de Absorbancia vs Tiempo en segundos. Esta curva será la Curva del progreso de la reacción. La parte que más nos concierne es la parte linear temprana (antes de que comiencen a estabilizarse las lecturas). Dibuje sobre esos puntos la mejor línea recta posible y calcule la pendiente de la línea (no de los datos). Las unidades de estas gráficas son en Abs sobre tiempo. Las unidades serán ahora M por unidad de tiempo. Este valor es, por definición, actividad enzimática.

7. Gráfica de Michaelis-Menten: Grafique la actividad enzimática como función de la concentración de sustrato (H₂O₂), al terminar de preparar la mezcla de reacción. Esta concentración se refiere a la que tienen en el tubo al comenzar a medir la absorbancia, la cual no es la misma con la que comenzaron luego de la dilución en serie. Para calcular la concentración de la mezcla de reacción utilice la fórmula C₁V₁ = C₂V₂. Verifique bien en el procedimiento lo que hicieron luego de la dilución en serie. Este cálculo de concentración será [S] en su gráfica.

8. Gráfica de Lineweaver-Burk: Calcule los recíprocos de la actividad enzimática y concentración de sustrato y grafique 1/v como función de 1/[S]. De esta gráfica, determine los valores para V_max y K_m, determinando los recíprocos de los interceptos en y y x de la gráfica. Sean muy cuidadosos con las unidades.

9. Con el valor de K_m obtenido, regrese a la gráfica de Michaelis-Menten. Identifique en ella su K_m, extrapole hasta la hipérbole, y localice en ese intercepto el valor de V_max/2. Calcule el valor de V_max y compare con el obtenido en la gráfica de Lineweaver-Burk.

TABLAS DE DATOS Y CALCULOS:

Lecturas de absorbancia en base a tiempo

	Lecturas de absorbancia
Tiempo, seg	Tubo 1	Tubo 2	Tubo 3	Tubo 4	Tubo 5	Tubo 6
0
15
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
ΔAbs/Δt
Actividad enzimática (v)

Recíprocos:

TUBO	v	[S] (moles)	1/v	1/[S] (moles)
1
2
3
4
5
6

CALCULOS:

1. Para cada tubo grafique Abs vs tiempo.

a. Determine la pendiente de cada gráfica (Abs vs t). Nos dará cambio en absorbancia por segundo. Esta pendiente (ΔAbs/Δseg) se usa para calcular la cantidad de producto que se genera por segundo. La pendiente se calcula de la parte donde se ve la parte de ascendencia rápida, a partir del tiempo 0. NO se toma en consideración la parte donde las lecturas comienzan a estabilizarse.

b. Determine la velocidad de generación de producto en cada tubo:

Actividad enzimática (en concentración/ segundo) = (ΔAbs/Δseg) / K_E,

K_E tetraguayacol = 26,600 / M seg

Recuerde: Las soluciones usadas están en milimoles y el

K_E está en moles. Convertir todo a moles antes de hacer

los demás cálculos. Usar notación científica.

2. Grafique la ecuación de Michaelis-Menten usando la actividad enzimática (velocidad de reacción, o sea cuántos moles de producto se generan por segundo), de los seis tubos, versus concentración de sustrato:

3. Determine el recíproco de las actividades enzimáticas y de [S] de cada tubo. (Tabla 2)

4. Grafique 1/v vs 1/[S] (L-B). La pendiente es K_M/V_max

a. Determine K_M y V_max , extrapolando la línea hasta

que interseque en y (1/V_max) y en x (-1/K_M)

5. Calcule los recíprocos para 1/V_max y -1/K_m.

6. Ubique K_M en la gráfica de Michaelis-Menten. Extrapole hacia la hipérbole y encuentre V_max/2. Compare con la V_max obtenida en la otra gráfica (L-B).

RESULTADOS:

1. Gráficas de Abs vs tiempo para los seis tubos: Seis gráficas.

2. Cálculos para convertir esa información en velocidad de reacción.

3. Cálculos de los recíprocos para la gráfica de Lineweaver- Burk.

4. Gráfica de Michaelis-Menten con todos los puntos importantes marcados: K_M, V_max/2, V_max.

5. Gráfica de Lineweaver-Burk con todos los puntos marcados: 1/ K_M, 1/ V_max

DISCUSION:

1. ¿Cuánto tardó cada gráfica en estabilizar las lecturas?

2. ¿Cuál de las reacciones tardó más en estabilizarse? ¿Cuál tardó menos?

3. ¿Qué le dice eso de la relación entre concentración de sustrato vs enzima?

4. ¿Qué concentración de sustrato debemos tener para alcanzar el grado de saturación de la enzima cuando tenemos una solución de enzima 1:2000?

Este ejercicio representa un gran porcentaje de su examen de laboratorio. Tenga especial cuidado en hacer su propio informe para que durante el examen sepa qué es lo que tiene que hacer y no tenga problemas mayores.

Gracias
INFORMACIÓN ADICIONAL SOBRE CINÉTICA DE ENZIMAS:

http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ3.htm

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (V_max). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v₀). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de abajo). De esta forma, la medida de v₀ se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v₀ frente a [S]₀ obtenemos una gráfica como la de la Figura de abajo. Cuando [S]₀ es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]₀, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]₀. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (V_max).

CÁLCULO DE LA K_M Y DE LA V_max DE UN ENZIMA

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v₀ frente a [S]₀) es una hipérbola (Figura de la izquierda). La V_max corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la K_M corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la V_max.

Para determinar gráficamente los valores de K_M y V_max es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v₀ frente a 1/[S]₀), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk (Figura de la derecha). Es una recta en la cual:

· La pendiente es K_M/V_max

· La abscisa en el origen (1/v₀ = 0) es -1/K_M

· La ordenada en el origen (1/[S]₀ = 0) es 1/V_max

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de K_M y V_max de un enzima para diversos sustratos

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).

Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 10⁶ µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 10⁶ U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10^-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10^-9 kat).

Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.

MOTIVOS QUE HACEN DE K_M UN PARÁMETRO CINÉTICO IMPORTANTE

La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante pór múltiples razones:

K_M es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si K_M = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = V_max/2. El valor de K_M da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor K_M, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor K_M, menor afinidad. Este hecho tiene fácil explicación si tenemos en cuenta que K_M se define como (k₂+k₃/k₁), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si K_M es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si K_M es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato). La K_M del sustrato natural es menor que la de los sustratos análogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta K_M, el que presente mayor K_M tiene menor afinidad por el enzima, y la reacción transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor K_M, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = V_max. Los valores de K_M de muchos enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.

http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ3.htm