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Ejercicio # 11a

Cromatografías de columna

 INTRODUCCION:

 Las cromatografías son un grupo de técnicas de separación selectiva de moléculas, en las que los componentes de una mezcla compleja de componentes pueden ser identificados y/o purificados. Existen varios tipos de cromatografías, según los criterios que se usan para hacer los análisis, pero todan consisten de una fase estacionaria y una móvil.

En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula A tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajará más rápido que A. Existen muchos tipos de cromatografía de columna. En el laboartorio de hoy veremos tres tipos de ellas.

A.      Filtración en gel: En esta las moléculas son separadas por su tamaño. El gel consiste de una cama de esferas con poros de un tamaño dado. El gel se conoce como sefadex, el cual viene con poros de distintos tamaños. Las moléculas de igual o menor tamaño que el poro entran a las esferas mientras que las moléculas más grandes pasan rápidamente por la columna. Las moléculas de tamaño intermedio pueden entrar las esferas pero pasan menos tiempo en ellas. Las moléculas salen en orden de tamaño por el eluído. Aunque para efectos de este laboratorio las muestras que usaremos están coloreadas, al hacer esta cromatografía en la vida real hay que usar otras pruebas para determinar qué fracciones contienen las muestras de interés, las cuales suelen ser proteínas. Estas pruebas pueden ser mediciones fotométricas, SDS-PAGE o ensayos enzimáticos. Una vez tenemos identificadas las fracciones con las muestras,podemos hacer un "profile" de elución con concentración en con concentración en Y y el volumen de elución en X. El volumen inicial es el "void volume" de la columna. Lo que contiene es en amortiguador que estaba dentro de la columna al empezar. Las moléculas más grandes salen inmediatamente después.

El material que se escoja para la fase estacionaria dependerá del tipo de muestra que estemos corriendo. Cada tipo de gel presenta poros de distinto tamaño. En nuestro caso usaremos Sephadex G-75, que separa moléculas entre 3,000 y 70,000 daltons. Moleculas mayores de 70,000 no estrarán a los poros de las esferas.

B.       Intercambio iónico: Se usa para purificar proteínas. Separa moléculas en base a su carga iónica. La fase estacionaria presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las moléculas de igual carga salen con el amortiguador. Las moléculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con distintos grados de afinidad. Para desprender las proteínas adheridas se usa una solución alta en cloruro de potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con incrementos moderados de salinidad, o de un solo paso, echando la solución de mayor concentración de sal primero. Al subir la concentración poco a poco podemos recolectar las muestras desde las que menos afinidad por la columna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elución, la sal va compitiendo con la proteína por las cargas de la matriz de la columna, hasta que la desprende.

La columna puede ser de matriz negativa (intercambio catiónico) o positiva (intercambio aniónico). El tipo de empaque dependerá de qué queremos aislar. En este tipo de columna el pH es importante porque puede alterar la carga de la columna.

En nuestro caso usaremos una mezcla de dos proteínas en una columna de intercambio catiónico y la eluiremos en un solo paso, con 1M KCl.

C.       Fase inversa: Esta es una cromatografía de interacción en la que la fase estacionaria, con moléculas hidrofóbicas, interactúa con moléculas hidrofóbicas en la muestra. La matriz conciste de fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraerán a las moléculas hidrofóbicas de la muestra mientras que las hidrofílicas salen con el amortiguador. Las moléculas son eluídas de la columna lavando con soluciones de distinta concentración de alcohol o cualquier otro solvente no polar.Nosotros usaremos unos cartuchos con C18 e isopropanol como solvente de elución.

 

MATERIALES:

Columna con sephadex G-75

Muestra, 300 μl

75 ml loading buffer (0.05 M imidazol pH 6.0)

vasos de precipitado

tubos de ensayo

soporte

pipetas de tansferencia

Columna con carboximetil celulosa (CM)

30 ml loading buffer (0.05 M imidazol pH 6.0)

15 ml elution buffer (0.05 M imidazol pH 6.0, 1M KCl)

Fracción 2 del primer experimento

Tubos y soportes

Cartucho Sep-Pac C-18

Jeringa de 3 cc

50 ml de agua

15 ml isopropanol al 8%

15 ml isopropanol al 35%

3 ml de refresco de uva sin gas

vasos

Clinistix

 

PROCEDIMIENTO:

A.      Filtración en gel

1.       Colocar la columna en forma vertical en el soporte. Colocar un vaso o un matraz debajo. Abra la columna y quite el tapón.

2.        Echar 1 ml loading buffer a la columna y dejarla gotear hasta que casi no quede buffer en la superficie del gel.

3.       Echar sobre la columna 300 μl de la muestra.

4.       Deje que la muestra penetre el empaque, hasta que la columna deje de gotear.

5.       Añada 0.5 ml de loading buffer a la columna tratando de no perturbar la superficie y deje gotear. Continúe echando buffer hasta que la primera banda de color esté a punto de salir.

6.       Coloque el primer tubo para recolectar la primera fracción coloreada.

7.       colocar de nuevo el vaso para recoger el buffer lasta que la siguiente fracción coloreada esté por salir.

8.       Continúe eluyendo las fracciones hasta obtener tres fracciones de distintos colores.

9.       Cuando termine, lave la columna, echando tres volúmenes de loading buffer.

10.   Sin que seque la columna tápela colocando el tapón inferior y la tapa superior.

11.   Remuévala del estante y guarde.

 

B.       Intercambio iónico. ****Esta columna gotea mucho más rápido que la de gel. Debe trabajar rápido y con todo a la mano****

1.       Colocar la columna de CM-celulosa en el soporte, colocar el vaso bajo la columna y abrirla.

2.       Déjela gotear hasta que casi no quede buffer sobre el empaque.

3.       Añada la fracción 2 que guardó de la primera parte del lab y deje que penetre el empaque.

4.       Lave dos veces con 0.5 ml de loading buffer, colocando el primer tubo de ensayo para recolectar la primera banda de color.

5.       Una vez colecte la muestra, coloque el vaso bajo la columna y lave con loading buffer hasta que salga incoloro.

6.       Coloque el segundo tubo y eche 10 gotas de elution buffer. Se supone que el color que se veía en la columna comienze a bajar.

7.       Siga añadiendo elution buffer hasta que remueva todo el color de la columna.

8.      Cuando termine lave la columna 5 veces con loading buffer.

 

C.       Fase inversa

1.       Marque cuatro vasos o tubos como W, 1.2 y 3.

2.       Abra una jeringa y llene con isopropanol al 35%.

3.       Conecte la jeringa al cartucho de C18 e inyecte el alcohol a través de la columna hacia el vaso con W.

4.       Equilibre la columna inyectando 3 volúmenes de agua. Lave y use la misma jeringa para esto.

5.       Inyecte 2 ml de refresco de uva colectando las gotas en el tubo 1. Debe salir claro.

6.       Eluya el colorante rojo inyectando tres volumenes de isopropanol al 8%. Recoja las gotas en el tubo #2. Si sigue viéndose color rosado en la columna añada más alcohol.

7.       Eluya el colorante azul con tres volúmenes de isopropanol al 35%. Recoja las gotas en el tubo 3. Continúe eluyendo hasta que no se vea más azul en la columna.

8.       Coloque un clinistix en las fracciones 1 a 3 para determinar presencia de azúcar.

 OBSERVACIONES

 Parte A:

1.       ¿Cuántas bandas de color aparecieron en la columna?

2.       ¿De qué colores son?

3.       ¿Cuál fue el orden de elución de las fracciones?

4.       Haga un dibujo de cómo se veía la columna durante la separación. Coloréela.

5.       ¿Qué puede concluir en cuanto al tamaño relativo de las moléculas en cada banda?

6.       ¿Cuál (es) de los colores puede moverse rodeando las esferas?

7.       ¿Cuál (es) de los colores puede moverse penetrando las esferas?

Parte B:

1.       ¿Cuántas bandas de color se obtuvieron de la fracción 2 en la parte 1?

2.       ¿Cuáles fueron los colores?

3.       ¿Por qué se separan estas moléculas en la parte 2?

4.       Describa las diferencias en comportamiento químico de estas moléculas, basado en sus observaciones.

5.       Identifique las moléculas encontradas en cada fracción, según su color:

Dextrán                 azul

DNP-glutamato    amarillo

Mioglobina             marrón

Citocromo c            rojizo

6.       Organice las moléculas en orden de tamaño.

7. ¿Por qué mioglobina y citocromo c no se separaron en la primera parte?

Parte C:

1.       ¿Cuál es el propósito del experimento de fase inversa?

2.       ¿Qué colorante se recolectó primero?¿Por qué?

3.       ¿Cuál es la función del alcohol?

4.       ¿Por qué se usan dos porcentajes de alcohol diferentes?

5.       ¿Qué pasaría si usamos el propanol al 35% primero?

6.       ¿Qué fracción tenía la mayor concentración de azúcar?

7.       ¿Qué significa el término eluído?

8.       ¿En qué se diferencia la cromatografía de fase inversa de la de filtración en geles?

 


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Ejercicio # 11b

 

Cromatografía de capa fina

 

 

INTRODUCCION:

 

La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas relativamente pequeñas. En la biología celular se utiliza frecuentemente para separar azúcares simples, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, metabolitos, y ocacionalmente para separar cadenas cortas de polipéptidos y ácidos nucleicos. Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una fase móvil y el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria o se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.

 

La fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel de silicato (vidrio molido bien fino) unido a una superficie sólida (una placa de vidrio, aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede ser rígida o flexible. El tipo de fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de moléculas que se quieran separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores fluorescentes. La fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente orgánico o una mezcla de ambos.

 

El procedimiento es sencillo: Se colocan las muestras a un centímetro del borde en uno de los extremos de la placa, se deja secar, se coloca la placa en un envase (tanque de desarrollo) que ya contiene una pequeña cantidad del solvente, se tapa y se deja correr por un rato. El solvente subirá por capilaridad e irá arrastrando las moléculas, las cuales se moverán según la afinidad que muestren por la fase estacionaria. Si la mezcla de muestras que se está analizando presenta color, se verán los distintos colores migrando a distintas velocidades. Si son incoloras hay que someter la placa a algún tratamiento con una sustancia desarrolladora (developer) para poder determinar la presencia de sustancias sobre el silicato. El tipo de desarrollador dependerá del tipo de moléculas que se analizan.

 

 

 

OBJETIVOS:

 

1.      Familiarizarse con otra técnica de separación de moléculas pequeñas, en este caso, aminoácidos.

2.      Determinar la composición de una mezcla de aminoácidos.

3.      Determinar el grado de afinidad de los aminoácidos, por medio del cálculo de Rf.

 

 

MATERIALES:

 

Placas de silicato de 5 x 20 cm

Tanque desarrollador con tapa

Guía para marcar la placa

Solvente (n-butanol: ácido acético: agua) (4:1:5)

Muestras de aminoácidos estándares (individuales)

Mezcla de aminoácidos experimental

Horno

Ninhidrina en atomizador (developer)

Pipeteador de 2 μl, con puntas

Lápiz

Regla (cm)

 

 

PROCEDIMIENTO:

 

1.      Teniendo mucho cuidado de no tocar la superficie de la placa de silicato con sus dedos, tome la suya y colóquela sobre la mesa. NO TOQUE LA PARTE DE LA PLACA CON EL POLVO DE SILICATO. SUS DEDOS TIENEN SUSTANCIAS QUE SE ADHIEREN A LA SUPERFICIE DEL SILICATO Y AFECTARA LA VISIBILIDAD DE LAS MUESTRAS.

2.      Haga una marca con lápiz a un centímetro del borde inferior de la placa de silicato, en los bordes laterales. Haga otra marca a 10 cm arriba de la marca inferior. Estas servirán de guía para colocar sus muestras y hasta dónde dejará correr la cromatografía. No use tinta porque esta se correrá con el solvente. No raye la placa de lado a lado: esto interferirá con el movimiento del solvente, al interrumpir la continuidad de la fase estacionaria.

3.      Utilizando la guía plástica para colocar muestras, coloque 2 μl de cada una de las muestras individuales (los estándares y la mezcla desconocida) sobre la placa de silicato. Si no tiene la guía, coloque las muestras a 1cm del borde inferior de la placa, usando de guía la marca que hizo a lapiz. Mantenga una separación de 1.5 cm entre las muestras. Quedarán unas manchitas de humedad sobre el silicato. Identifique cada uno de los puntos: numere el orden de cada mancha. Anote en su libreta los estándares usados según el orden en que colocó en el silicato, y la  posición de su desconocido.

4.      Coloque la placa de silicato, SIN la guía plástica, en el horno por 5 minutos, para secarla.

5.      Saque la placa, deje que se enfríe y repita el procedimiento de muestreo como en el paso 2. Esto le permitirá concentrar sus muestras para que los puntos se vean más claros. Asegúrese de que la segunda muestra que coloca en cada punto es la misma que en el primer muestreo. NO LAS MEZCLE.

6.      Luego se secar al horno y dejar enfriar, coloque las placas en el tanque desarrollador con solvente. El solvente debe tener menos de 1 cm de profundidad para que no entre en contacto directo con las muestras. Tape el tanque porque el solvente es bastante volátil y se evapora con facilidad.

7.      Deje que el solvente suba por capilaridad hasta unos 10 cm del punto donde usted colocó las muestras. (Hasta la marca superior.)

8.      Si por falta de tiempo no se puede esperar hasta que el solvente llegue a 10 cm, marque con lápiz hasta dónde subió el solvente.

9.      Seque en el horno por 5 minutos.

10.  Saque, deje enfriar y rocíe con ninhidrina. Esta es una sustancia que se adhiere a los aminoácidos y los tiñe. Tenga cuidado al rocear la ninhidrina o se mancharán las manos por varios días.

11.  Coloque de nuevo en el horno por varios minutos hasta que note manchas de colores.

12.  Mida la distancia recorrida por cada mancha desde el lugar donde colocó la muestra hasta el centro de la mancha de color.

13.  Como marcó el punto de origen y el punto hasta donde corrió el solvente, mida esta distancia también.

14.  Anote el color de cada una de las manchas.

 

 

RESULTADOS:     

 

1.      Haga un dibujo de su placa, identificando cada uno de los estándares.

2.      Calcule en Rf de cada muestra estándar y determine cuál(es) es (son) el (los) desconocido(s) de su muestra.

Rf = Distancia corrida por la muestra

               Distancia solvente

 

Distancia recorrida por el solvente: ________________

 

 

Número

Nombre de la Muestra

Color de la mancha

Distancia recorrida

Rf

1

 

 

 

 

2

 

 

 

 

3

 

 

 

 

4