BIOL 3010L

Ejercicio #7

Electroforesis de isoenzimas LDH

INTRODUCCIÓN:

El término isoenzima fue acuñado por C.L. Markert y F. Moller in 1959 para describir múltiples enzimas con especificidad de sustrato igual (enzimas distintas que trabajan sobre un mismo sustrato) o muy similar, y que ocurren en el mismo organismo. Markert luego propuso modificar el término para que incluyera adjetivos como alélico, no-alélico, multimérico, conformacional y conjugado. Estos adjetivos implican una definición más amplia del término isoenzima y por lo tanto ahora incluye variaciones genéticas y modificaciones fisiológicas de las estructuras proteicas.

La deshidrogenasa láctica (LDH) es una enzima que se encuentra en la sangre y es ideal para el análisis de isoenzimas por electroforesis. La enzima consiste de cinco isoenzimas electroforéticamente separables identificadas como LDH-1, LDH-2, LDH-3, LDH-4 y LDH-5, en el orden de su razón de migración electroforética, con LDH-1 siendo la más rápida. Como estas enzimas están asociadas a fuentes en tejidos u órganos específicos, sus concentraciones relativas en suero pueden proveer información en la diferenciación de enfermedades como infarto de miocardio, necrosis del hígado, infarto pulmonar, distrofia muscular primaria, anemia perniciosa y cáncer. Ya hay disponibles en el mercado pruebas de diagnóstico para estas enfermedades que incluyen el análisis de LDH.

Las enzimas LDH son importantes indicadores de diferenciación celular. El análisis de la síntesis de péptidos para isoenzimas se usa como un análisis clásico de la actividad génica diferencial, que nos permite detectar actividad en ciertos tejidos. LDH-1 consiste de cuatro cadenas de un péptido especie A, mientras que LDH-5 consiste cuatro cadenas de un péptido especie B. LDH-2 a 4 son permutaciones de ambas especies génicas combinadas en un tetrámero funcional. El que LDH-1 o LDH-5 se produzcan depende de la actividad del gen A o B respectivamente. Si ambos genes están activos a la vez, y la concentración de cada péptido es equimolar, LDH-3 (AABB) sería la forma dominante. El tetrámero LDH es una molécula autoensamblable que depende de la concentración relativa de sus componentes para su forma tetramérica. Por ello, la distribución de isoenzimas puede analizarse estadísticamente y determinar el grado al que los genes A y/o B están trabajando. Esto implica que no necesariamente se verán los cinco tipos de isoenzimas a la vez, en la corrida de una muestra de suero. El número y concentración de isoenzimas presentes en la muestra dependerán de la actividad metabólica de los tejidos del individuo del que se toma la muestra y de las condiciones de salud que pueda presentar.

OBJETIVOS:

1. Aprender a manejar un gel de poliacrilamida y el proceso de electroforesis.

2. Determinar la presencia de enzimas (deshidrogenasa de lactato, LDH) en muestras de suero utilizando reacciones enzimáticas directamente sobre el gel.

MATERIALES:

1.0 1.0 M Tris-HCl pH 8.8

Solución de acrilamida/bisacrilamida (30% : 0.8%) (29% : 1%)

10% (w/v) persulfato de amonio

40% (w/v) sucrosa

TEMED

Aparato vertical de electroforesis

Amortiguador de corrida Tris-glicina

Tinte de LDH preparado al momento de usar: 8 partes sln. A y 1 parte sln. B:

Solución A:

Lactato de sodio al 60% (sustrato) 2.4 ml

Nitroblue tetrazolium 0.03 g

Metosulfato de fenazina 0.003 g

Amortiguador de sodio/fosfato hasta completar 100 ml

Solución B:

NAD al 0.5% (w/v) Usar 5 mg/ ml agua 10 ml

Agua destilada y desionizada

Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml.

Microcentrífuga

Muestras de suero de sangre de mamífero

Equipo de electroforesis

Micropipeteadores (10-300 μl)

Guantes

Batas de laboratorio

Bolsas sellables

Papel de aluminio

Acido acético al 7%

PROCEDIMIENTOS:

1. Preparación del gel:

OJO: Se dividirán en dos grupos y cada grupo será responsible de preparar un gel. Las instrucciones que siguen deben ser realizadas por cada grupo.

a. Montar el equipo de electroforesis, teniendo todo a mano. Usar separadores de 0.75 mm y la peinilla de 10 fosas. Es importante que cotejen lo que van a necesitar porque tienen que moverse rápido y sin accidentes. Una vez se añaden los catalizadores el gel comienza a polimerizar. Deben asegurarse de que el eguipo está completamente limpio. Algunas impurezas pueden evitar que el gel polimerice. Al calcular la cantidad de polimerizante que se necesita se hace a base de 50 μl de persulfato y 10 μl de TEMED por cada 15 ml de gel

b. Su instructor se hará responsible de la mezcla para los geles:

Preparar el gel de separación al 5% mezclando lo siguiente (da para dos minigeles):

Acrilamida al 30% 3.33 ml

Amortiguador Tris-HCl pH 8.8 3.33 ml

Agua destilada y desionizada 13.23 ml

Persulfato de amonio (catalítico) 100 μl

TEMED (catalítico) 30 μl

PRECAUCIÓN: LA ACRILAMIDA ES ALTAMENTE TÓXICA Y CARCINOGÉNICA EN SU ESTADO LÍQUIDO. TENGA MUCHO CUIDADO AL MANEJARLA. UNA VEZ SE POLIMERIZA NO HAY PELIGRO. NO DESCARTE ACRILAMIDA LÍQUIDA POR EL FREGADERO. SÓLO DESCARTE ACRILAMIDA UNA VEZ ESTÉ POLIMERIZADA.

c. Una vez la mezcla esté lista, vertir en el molde con ayuda de una pipeta, teniendo cuidado de no tirar gel fuera del molde. Debe hacerlo de manera que no queden burbujas dentro del gel. Llenar hasta el borde.

d. Colocar la peinilla, entrándola inicialmente en forma inclinada para evitar burbujas de aire, y dejar polimerizando por 30 minutos.

e. Diluir un volumen de amortiguador Tris-glicina en cuatro de agua.

f. Al terminar la polimerización, sacar la peinilla con mucho cuidado, enjuagar las fosas con agua destilada y llenarlas con amortiguador de corrida, Tris-glicina 1X.

2. Preparación de la muestra:

a. Determinar la cantidad de muestras de plasma con las que van a trabajar.

b. Preparar un tubo de microcentrífuga para cada muestra de plasma, añadiendo 28 μl de sacarosa al 40% y 2 μl de bromofenol azul a cada tubo. La sucrosa dará densidad al plasma para evitar que flote dentro de la fosa y se salga. El bromofenol azul es una molécula bien pequeña y coloreada que se usa para indicar por dónde va corriendo el frente de la electroforesis para no perder la muestra.

c. Se toman 10 μl de cada una de las muestras de plasma disponibles y se echan en los microtubos de forma individual.

d. En otros dos tubos, echar 18 μl de sacarosa al 40 % y 2μl de bromofenol azul.

e. A uno de ellos echar 1 μl de LDH-1 y en el otro echar 1μl de LDH-5. Estos serán los estándares.

f. En la fosa 1 echar 10 μl del estandar LDH-1 y en la 2 echar 10 μl de estandar de LDH-2.

g. Echar 20 μl de muestra en cada una de dos fosas, con mucho cuidado para que no se riegue a las fosas vecinas. Para cada tubo usará dos fosas.

3. Corrida del gel:

a. Llenar los depósitos de la cámara con amortiguador de Tris-glicina.

b. Colocar la tapa de la cámara.

c. Conectar los electrodos y correr a 20 mA o a 100 V hasta que la marca del bromofenol llegue lo más cerca del fondo posible, aproximadamente una hora.

4. Tinción:

a. Cortar una esquina del gel, anotando el sitio del corte en su libreta. Esto le ayudará a identificarlo. Separar con mucho cuidado el gel del molde y echarlo, empujándolo con chorritos de agua destilada, en una bolsa plástica sellable (zip lock). Al tener una concentración de acrilamida menor que la de otros geles, su gel es muy delicado y puede romperse con facilidad. PONGA MUCHO CUIDADO AL MANIPULAR SU GEL.

b. Enjuagar con agua destilada y descartar el agua.

c. Cuando esté listo el gel, echar 18 ml de solución de tinte fresca (16 ml sln A y 2 ml sln B). Tapar de inmediato envolviendo con papel de aluminio e incubar a 37˚C por 60 minutos en oscuridad. EL SUSTRATO ES BIEN SENSITIVO A LA LUZ. En su lugar, pueden dejarlo hasta el otro día a temperatura ambiental (MEJOR).

d. Decantar el tinte, enjuagar con agua destilada y cubrir el gel con ácido acético al 7%. Tapar de inmediato y dejar reposando por 60 minutos más en la oscuridad.

e. Decantar el ácido acético usado y echar ácido fresco. Desteñir por otra hora.

f. Decantar el segundo desteñido y echar más ácido acético si fuera necesario.

g. Hacer las observaciones pertinentes.

El gel debe estar lo más desteñido posible para no confundir las bandas azul-púrpura de la reacción con las manchas del tinte o del bromofenol azul.

REACCIÓN ESPERADA:

Lactato + NAD → Piruvato + NADH

NADH + Metasulfato de fenazina → NAD + Metasulfato de fenazina

(oxidado) (reducido)

Metafulfato fenazina + Nitroblue tetrazolium → Nitroblue tetrazolium + Metasulfato fenazina

(reducido) (formazen) (oxidado)

(precipitado violeta)

Resultados:

1. Dibujar el gel, midiendo la distancia que recorrieron las bandas. Anote todas las observaciones que pueda hacer.

2. ¿Cuántas bandas presenta su muestra?

3. Compare la intensidad del color entre las distintas bandas. Según lo observado, cuál de los isómeros es el más predominante en su gel?

4. La única forma de saber con certeza cuáles isómeros esta presentes es usando un estandar para LDH. De todas formas, ¿qué puede inferir sobre las bandas que ve?