BIOL 3010L

Ejercicio #2

Equipos de laboratorio

 

 

Introducción

 

Durante este semestre estaremos realizando una serie de ejercicios de laboratorio que requieren el manejo de distintos artefactos. En este primer ejercicio estaremos revisando el uso apropiado de algunos de ellos, para facilitarles el trabajo en futuros experimentos.

 

 

El espectrofotómetro

Uno de los instrumentos principales del laboratorio de biología celular es el espectrofotómetro. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de un largo de onda particular)  a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al fisiólogo realizar dos funciones:

1.      Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo midiendo la absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (l) y graficar estos valores en función del largo de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas propiedades espectrales únicas, distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un arreglo de átomos tridimensional particular que hace que cada sustancia tenga características únicas. Al ser expuestos a la luz del especrofotómetro, algunos electrones de los átomos que forman las moléculas absorben energía entrando a un estado alterado. Al recuperar su estado original, la energía absorbida es emitida en forma de fotones. Esa emisión de fotones es distinta para cada sustancia, generando un patron particular, que varía con el largo de onda usado. Dependiendo del largo de onda, será la cantidad de energía absorbida por una sustancia, lo que logra generar un espectro particular al graficar Abs vs l

2.      Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. La concentración es proporcional a la absorbancia, según la Ley Beer-Lambert: a mayor cantidad de moléculas presentes en la muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida por sus electrones.

 

Abs = K C L                Abs: absorbancia

                                    K: coeficiente de extinción molar

                                    C: concentración

L: distancia que viaja la luz a traves de la muestra. (normalmente es de 1 cm)

La cuveta promedio, que guarda la muestra, tiene dimensiones internas de un centímetro (L).  La ecuación describe una línea recta, donde el origen es cero. Si L es constante (1.0 cm) y se conoce el valor de K,  podemos calcular C en base a Abs:

Abs / K L = C  

            El espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz ultravioleta y visible (200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del haz. Este haz atraviesa la muestra y llega a un tubo fotográfico, donde es medido. La cantidad de luz que atraviesa la muestra es el porcentaje (%) de tramitancia. Podemos usar esta unidad o cambiarla a absorbancia usando la siguiente ecuación.

                                                   %T = - Log Abs.

El espectrofotómetro nos puede dar ambos valores a la misma vez, ahorrando la necesidad de hacer los cálculos. (Tramitancia= cantidad de luz que atravieza la mezcla).

Una característica del instrumento es la necesidad de “blanquear” el aparato antes de cada lectura. Esto se hace colocando una cuveta con una solución control que tenga todos los componentes de la reacción menos la sustancia que va a ser medida en el instrumento y ajustando la lectura a cero absorbancia. El propósito de esto es eliminar el registro de absorbancia (background) que puedan presentar los demás componentes de la reacción a ese largo de onda particular. Todas las moléculas presentan absorbancia porque todas interfieren con el paso de la luz. Sólo que la absorbancia será óptima a un largo de onda de luz específico para cada tipo de sustancia.

 

Cuvetas

Las cuvetas son unos viales de plástico transparente o cuarzo que dejan pasar la luz. Los mejores para trabajos de investigación son las de cuarzo porque su interferencia al paso de la luz es mínimo. Son más costosas inicialmente pero bien tratadas pueden ser reusables. Las de plástico vienen con distintas características. Por lo general son desechables, aunque pueden reusarse. El tipo de cuveta plástica a usar depende del rango de luz en el que se van a analizar las muestras. Vienen unas para luz visible, que son las más económicas,  y otras para el rango de visible a ultravioleta. Estas son más versátiles.

Ambos tipos de cuvetas deben manejarse con cuidado para evitar rallazos sobre la superficie por donde pasa la luz. Si la cuveta está rallada, los rayos de luz que incidan en la zona se difractan y no pasan por la muestra, por lo que  puede dar lecturas de absorbancia erróneas. Esto es especialmente crítico cuando queremos determinar concentración en una muestra. Antes de tomar una lectura, debemos observar que la cuveta no tenga rallazos ni esté sucia. Si se ven marcas de polvo u otro tipo de sucio la cuveta debe limpiarse con papel tisú (Kimwipes). Si la cuveta se manipula mucho, debemos sostenerla usando papel tisú para evitar pegarle los aceites que normalmente tenemos en las manos. No debemos usar ningún otro tipo de papel para limpiar las cuvetas, puesto que pueden soltar fibras que pudieran caer en la muestra o rallar la superficie.

Las cuvetas viene en distintos volúmenes, desde 1 ml hasta 4 ml. El volumen a escoger depende de la cantidad de muestra disponible. Si la muestra disponible es poca o difícil de conseguir, lo mejor es usar una cuveta de menor volumen para perder la menor cantidad posible de la muestra. Por lo general, la muestra utilizada para hacer la lectura se pierde, sobre todo si es una sustancia bien sensitiva, como el ADN.

 

 

Pipetas y pipeteadores

           Usamos las pipetas para medir volúmenes de líquidos de forma más precisa que con una probeta. Y son más versátiles, sobre todo al manejar volúmenes pequeños.

            Las pipetas de bulbo son útiles para medir volúmenes que no requieren de mucha presición. Antes se usaban pipetas "Pasteur" de cristal a las que se les aditaba un bulbo de goma que se usaba para succionar el líquido. Ahora vienen en plástico desechable de una sola pieza y se consiguen con o sin calibración.

            Las pipetas volumétricas vienen en distintos tamaños, desde 1 ml hasta 200 ml, y con distintas formas, de acuerdo al uso que se les dé. También vienen en distintos materiales como borosilicato y plástico, desechables o reusables, estériles o sin esterilizar. Algunas pueden ser esterilizadas en horno o autoclave. Para llenarlas se pueden usar bulbos de caucho, bombas manuales o eléctricas, o equipos de llenado. Las bombas eléctricas y los equipos de llenado son muy útiles si se está trabajando con múltiples muestras, pues minimizan la fatiga del técnico.

            Las micropipetas son extremadamente útiles en los laboratorios de biotecnología. Estas permiten medir con presición volúmenes tan pequeños como 0.1 μl hasta 1 ml. Estas requieren de unos pipeteadores especiales que deben der tratados con mucho cuidado para evitar que se descalibren. Los pipeteadores vienen de distintos tipos. La mayoría pueden servir muestras individuales. Pero vienen los que pueden servir muestras múltiples, por medio de multicanales: pipetas que sirven 8 o 12 muestras a la vez. Estas son muy útiles al hacer pruebas de ELISA, donde se practican diluciones seriadas multiples, o para preparar reacciones de varias muestras distintas a la vez. Se usan en conjunto con platos de fosas múltiples.

            Las puntas de micropipetas vienen con distintas características de acuerdo al uso que se les dé. Vienen con punta ancha, estrecha o aplanada, con o sin filtros contra aerosoles, estériles o sin esterilizar  y pueden ser esterilizadas en autoclave.

 

Aparatos de electroforesis

            Estos son unas cámaras que contienen un circuito eléctrico expuesto a un líquido electrolítico, llamado amortiguador. El aparato se usa para separar mezclas de moléculas grandes de acuerdo a su carga y/o su tamaño. La técnica consiste en inocular la muestra en un medio semisólido, la fase estacionaria, que se somete a un campo eléctrico, en una cámara donde en un extremo se encuentra un filamento que actúa como polo positivo, y en el extremo opuesto hay otro filamento formando el polo negativo. Las moléculas con cargas netas positivas se moverán hacia el polo negativo y las de carga negativa se irán hacia el polo positivo. Luego de la muestra ser tratada apropiadamente dependiendo del tipo de electroforesis, las moléculas que viajen hacia uno de los polos se separarán por tamaño, viajando más en la fase estacionaria las moléculas más pequeñas. El tipo y concentración de la fase estacionaria dependerá del tipo de moléculas que nos interesa correr.

 

Centrífugas

            Son muy útiles para precipitar células y moléculas. Vienen en distintos tamaños y con distintas capacidades en el manejo de muestras. Este aparato somete la muestra a fuerzas de aceleración que obligan a las moléculas a concentrarse en el fondo del envase utilizado, separándolas del medio en que se encuentran. Incluso, bajo ciertos métodos se puede generar un gradiente de concentraciones dentro del mismo tubo, separando distintas moléculas a distintos niveles o fases dentro del tubo. Con ayuda de jeringas, se puede perforar la pared del tubo y extraer del mismo sólo aquella fase donde se encuentren las moléculas de interés.

            Entre las centrífugas que usaremos durante el semestre están la centrífuga refrigerada, que nos va a permitir separar células de los medios de cultivo. El rotor de esta centrifuga puede sostener tubos de 50 ml, pero puede ser intercambiado por rotores que sostienen botellas de cultivo.

            La microcentrífuga es una versión más pequeña de la descrita anteriormente. Es compacta, se coloca sobre la mesa y procesa muestras de hasta 2 ml. Es muy útil para precipitar ADN y otras sustancias que se trabajan en volúmenes pequeños.

           

Equipo de cromatografía

            Haremos varias cromatografias al final del semestre. En una cromatografía buscamos separar uno o varios tipos de moléculas, relativamentre pequeñas, de una mezcla de sustancias o para purificar muestras. Existen varios tipos de cromatografías. La que se utilice dependerá del tipo de moléculas que buscamos aislar.

            La cromatografía de capa fina es ideal para separar muestras pequeñas. Presenta dos componentes: una fase estacionaria y una fase móvil. La fase estacionaria consiste de una placa de vidrio o celulosa impregnada con polvo de silicato (vidrio molido extremadamente fino). Las muestras se colocan a un centímetro del borde inferior y se coloca en un tanque de revelado que contiene algun tipo de solvente en el fondo. La placa se coloca de forma que el solvente no toque directamente las muestras. La fase móvil consiste del solvente. El solvente a usarse dependerá de las propiedades químicas de los componentes de la mezcla.

            El solvente sube por capilaridad por la superficie impregnada con las muestras. Los componentes de la mezcla comenzarán a migrar, según el grado de afinidad que tengan por el solvente y/o la fase estacionaria. Mientras más afín sea algún componente a la fase móvil, más rápido se moverá y más lejos llegará en su migración sobre la fase estacionaria.

            En la cromatografía de columna se pueden separar volúmenes más grandes de muestras. Tambien tiene una fase estacionaria que consiste de un tubo conteniendo un material que separa la mezcla analizada. Los amortiguadores que se usan para lavar la columna constituyen la fase móvil.

            El empaque de las columnas puede separar moléculas por su tamaño, por sus interacciones iónicas o por interacciones hidrofóbicas. El tipo de empaque a usar dependerá de las propiedades de la muestra.

            Existen otros tipos de cromatografía más sofisticados, que se usan en laboratorios de investigación y en procesos de manufactura en varios tipos de industrias. Nosotros nos limitaremos a los descritos anteriormente.

 

Práctica:

  1. Practique el uso de las micropipeteadoras manuales, midiendo distintos volumenes de tinte y colocándolos sobre un papel encerado. Mida 5, 10, 20 y 100 microlitros.
  2. Compare el tamaño de las gotas sobre el papel.
  3. Eche los mismos volúmenes en un microtubo.
  4. Compare el tamaño de las gotas en el  tubo.

 

Tengan especial cuidado con las micropipeteadoras. Las mismas tienen dos puntos de resistencia, que se sienten al oprimir el émbolo. Al medir un volumen de líquido, se pone la punta adecuada el el extremo del aparato y se oprime el émbolo hasta que se sienta esa primera resistencia suave. Se introduce la punta en el líquido y se suelta el émbolo. Al este subir, se genera el vacío necesario para succionar el volumen de líquido previamente establecido.

Al servir la muestra, se oprime el émbolo hasta la primera resisatencia. Se supone que casi todo el líquido salga de la punta. Oprimir el émbolo hasta la segunda resistencia para expulsar la última gota de muestra, si quedara algo en la punta. No volver a soltar el émbolo hasta que haya removido la punta de pipeta del tubo donde ha estado sirviendo la muestra, para evitar volver a succionar parte de esta.

 

 

 

Equipo para electroforesis de poliacrilamida (vertical):

                   

 

Camara de electroforesis horizontal:

 

                                               

 

 

 

 

 

 

Pipeteadoras automaticas.

 

                                 

 

 

P2

                                = 1µL

 

2÷20

                            = 10µL

 

 

 

 

 

 

P20

                            = 10µL

 

P200

                             = 100µL

 

P1000

                            = 1000µL