BIOL 3010L
Ejercicio #2
Equipos de laboratorio
Introducción
Durante este semestre estaremos realizando una serie de ejercicios de
laboratorio que requieren el manejo de distintos artefactos. En este primer
ejercicio estaremos revisando el uso apropiado de algunos de ellos, para
facilitarles el trabajo en futuros experimentos.
El espectrofotómetro
Uno de los instrumentos principales del
laboratorio de biología celular es el espectrofotómetro. Este instrumento tiene
la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de un largo de onda
particular) a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es
absorbida por dicha muestra. Esto le permite al fisiólogo realizar dos
funciones:
1.
Nos da
información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos
lograrlo midiendo la absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (l) y graficar estos
valores en función del largo de onda, formando un espectrograma. Como cada
sustancia tiene unas propiedades espectrales únicas, distintas sustancias
producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un
arreglo de átomos tridimensional particular que hace que cada sustancia tenga
características únicas. Al ser expuestos a la luz del especrofotómetro, algunos
electrones de los átomos que forman las moléculas absorben energía entrando a
un estado alterado. Al recuperar su estado original, la energía absorbida es emitida
en forma de fotones. Esa emisión de fotones es distinta para cada sustancia,
generando un patron particular, que varía con el largo de onda usado.
Dependiendo del largo de onda, será la cantidad de energía absorbida por una
sustancia, lo que logra generar un espectro particular al graficar Abs vs l
2.
Nos
dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la
muestra. La concentración es proporcional a la absorbancia, según la Ley
Beer-Lambert: a mayor cantidad de moléculas presentes en la muestra, mayor será
la cantidad de energía absorbida por sus electrones.
Abs = K C L
Abs: absorbancia
K: coeficiente de extinción molar
C: concentración
L: distancia que viaja la luz a traves de la
muestra. (normalmente es de 1 cm)
La cuveta promedio, que guarda la muestra,
tiene dimensiones internas de un centímetro (L). La ecuación describe una
línea recta, donde el origen es cero. Si L es constante (1.0 cm) y se conoce el
valor de K, podemos calcular C en base a Abs:
Abs / K L = C
El
espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz
ultravioleta y visible (200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un
prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo al largo de onda escogido.
Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del haz. Este
haz atraviesa la muestra y llega a un tubo fotográfico, donde es medido. La
cantidad de luz que atraviesa la muestra es el porcentaje (%) de tramitancia.
Podemos usar esta unidad o cambiarla a absorbancia usando la siguiente ecuación.
%T = - Log Abs.
El
espectrofotómetro nos puede dar ambos valores a la misma vez, ahorrando la
necesidad de hacer los cálculos. (Tramitancia= cantidad de luz que atravieza la
mezcla).
Una característica del instrumento es la necesidad de “blanquear” el
aparato antes de cada lectura. Esto se hace colocando una cuveta con una
solución control que tenga todos los componentes de la reacción menos la
sustancia que va a ser medida en el instrumento y ajustando la lectura a cero
absorbancia. El propósito de esto es eliminar el registro de absorbancia
(background) que puedan presentar los demás componentes de la reacción a ese
largo de onda particular. Todas las moléculas presentan absorbancia porque
todas interfieren con el paso de la luz. Sólo que la absorbancia será óptima a
un largo de onda de luz específico para cada tipo de sustancia.
Cuvetas
Las cuvetas son unos viales de plástico
transparente o cuarzo que dejan pasar la luz. Los mejores para trabajos de
investigación son las de cuarzo porque su interferencia al paso de la luz es
mínimo. Son más costosas inicialmente pero bien tratadas pueden ser reusables.
Las de plástico vienen con distintas características. Por lo general son
desechables, aunque pueden reusarse. El tipo de cuveta plástica a usar depende
del rango de luz en el que se van a analizar las muestras. Vienen unas para luz
visible, que son las más económicas, y otras para el rango de visible a
ultravioleta. Estas son más versátiles.
Ambos tipos de cuvetas deben manejarse con
cuidado para evitar rallazos sobre la superficie por donde pasa la luz. Si la
cuveta está rallada, los rayos de luz que incidan en la zona se difractan y no
pasan por la muestra, por lo que puede dar lecturas de absorbancia
erróneas. Esto es especialmente crítico cuando queremos determinar
concentración en una muestra. Antes de tomar una lectura, debemos observar que
la cuveta no tenga rallazos ni esté sucia. Si se ven marcas de polvo u otro
tipo de sucio la cuveta debe limpiarse con papel tisú (Kimwipes). Si la cuveta
se manipula mucho, debemos sostenerla usando papel tisú para evitar pegarle los
aceites que normalmente tenemos en las manos. No debemos usar ningún otro tipo
de papel para limpiar las cuvetas, puesto que pueden soltar fibras que pudieran
caer en la muestra o rallar la superficie.
Las cuvetas viene en distintos volúmenes, desde
1 ml hasta 4 ml. El volumen a escoger depende de la cantidad de muestra
disponible. Si la muestra disponible es poca o difícil de conseguir, lo mejor
es usar una cuveta de menor volumen para perder la menor cantidad posible de la
muestra. Por lo general, la muestra utilizada para hacer la lectura se pierde,
sobre todo si es una sustancia bien sensitiva, como el ADN.
Pipetas y pipeteadores
Usamos
las pipetas para medir volúmenes de líquidos de forma más precisa que con una
probeta. Y son más versátiles, sobre todo al manejar volúmenes pequeños.
Las
pipetas de bulbo son útiles para medir volúmenes que no requieren de mucha
presición. Antes se usaban pipetas "Pasteur" de cristal a las que se
les aditaba un bulbo de goma que se usaba para succionar el líquido. Ahora
vienen en plástico desechable de una sola pieza y se consiguen con o sin
calibración.
Las
pipetas volumétricas vienen en distintos tamaños, desde 1 ml hasta 200 ml, y
con distintas formas, de acuerdo al uso que se les dé. También vienen en
distintos materiales como borosilicato y plástico, desechables o reusables,
estériles o sin esterilizar. Algunas pueden ser esterilizadas en horno o
autoclave. Para llenarlas se pueden usar bulbos de caucho, bombas manuales o
eléctricas, o equipos de llenado. Las bombas eléctricas y los equipos de
llenado son muy útiles si se está trabajando con múltiples muestras, pues
minimizan la fatiga del técnico.
Las
micropipetas son extremadamente útiles en los laboratorios de biotecnología.
Estas permiten medir con presición volúmenes tan pequeños como 0.1 μl hasta 1 ml. Estas requieren de unos pipeteadores
especiales que deben der tratados con mucho cuidado para evitar que se
descalibren. Los pipeteadores vienen de distintos tipos. La mayoría pueden
servir muestras individuales. Pero vienen los que pueden servir muestras
múltiples, por medio de multicanales: pipetas que sirven 8 o 12 muestras a la
vez. Estas son muy útiles al hacer pruebas de ELISA, donde se practican
diluciones seriadas multiples, o para preparar reacciones de varias muestras
distintas a la vez. Se usan en conjunto con platos de fosas múltiples.
Las
puntas de micropipetas vienen con distintas características de acuerdo al uso
que se les dé. Vienen con punta ancha, estrecha o aplanada, con o sin filtros
contra aerosoles, estériles o sin esterilizar y pueden ser esterilizadas
en autoclave.
Aparatos de electroforesis
Estos
son unas cámaras que contienen un circuito eléctrico expuesto a un líquido
electrolítico, llamado amortiguador. El aparato se usa para separar mezclas de
moléculas grandes de acuerdo a su carga y/o su tamaño. La técnica consiste en
inocular la muestra en un medio semisólido, la fase estacionaria, que se somete
a un campo eléctrico, en una cámara donde en un extremo se encuentra un
filamento que actúa como polo positivo, y en el extremo opuesto hay otro
filamento formando el polo negativo. Las moléculas con cargas netas positivas
se moverán hacia el polo negativo y las de carga negativa se irán hacia el polo
positivo. Luego de la muestra ser tratada apropiadamente dependiendo del tipo
de electroforesis, las moléculas que viajen hacia uno de los polos se separarán
por tamaño, viajando más en la fase estacionaria las moléculas más pequeñas. El
tipo y concentración de la fase estacionaria dependerá del tipo de moléculas
que nos interesa correr.
Centrífugas
Son muy útiles para
precipitar células y moléculas. Vienen en distintos tamaños y con distintas
capacidades en el manejo de muestras. Este aparato somete la muestra a fuerzas
de aceleración que obligan a las moléculas a concentrarse en el fondo del
envase utilizado, separándolas del medio en que se encuentran. Incluso, bajo
ciertos métodos se puede generar un gradiente de concentraciones dentro del
mismo tubo, separando distintas moléculas a distintos niveles o fases dentro
del tubo. Con ayuda de jeringas, se puede perforar la pared del tubo y extraer
del mismo sólo aquella fase donde se encuentren las moléculas de interés.
Entre las centrífugas
que usaremos durante el semestre están la centrífuga refrigerada, que nos va a
permitir separar células de los medios de cultivo. El rotor de esta centrifuga
puede sostener tubos de 50 ml, pero puede ser intercambiado por rotores que
sostienen botellas de cultivo.
La microcentrífuga es
una versión más pequeña de la descrita anteriormente. Es compacta, se coloca
sobre la mesa y procesa muestras de hasta 2 ml. Es muy útil para precipitar ADN
y otras sustancias que se trabajan en volúmenes pequeños.
Equipo de cromatografía
Haremos varias
cromatografias al final del semestre. En una cromatografía buscamos separar uno
o varios tipos de moléculas, relativamentre pequeñas, de una mezcla de
sustancias o para purificar muestras. Existen varios tipos de cromatografías.
La que se utilice dependerá del tipo de moléculas que buscamos aislar.
La cromatografía de
capa fina es ideal para separar muestras pequeñas. Presenta dos componentes:
una fase estacionaria y una fase móvil. La fase estacionaria consiste de una
placa de vidrio o celulosa impregnada con polvo de silicato (vidrio molido
extremadamente fino). Las muestras se colocan a un centímetro del borde
inferior y se coloca en un tanque de revelado que contiene algun tipo de
solvente en el fondo. La placa se coloca de forma que el solvente no toque
directamente las muestras. La fase móvil consiste del solvente. El solvente a
usarse dependerá de las propiedades químicas de los componentes de la mezcla.
El solvente sube por
capilaridad por la superficie impregnada con las muestras. Los componentes de
la mezcla comenzarán a migrar, según el grado de afinidad que tengan por el
solvente y/o la fase estacionaria. Mientras más afín sea algún componente a la
fase móvil, más rápido se moverá y más lejos llegará en su migración sobre la
fase estacionaria.
En la cromatografía de
columna se pueden separar volúmenes más grandes de muestras. Tambien tiene una
fase estacionaria que consiste de un tubo conteniendo un material que separa la
mezcla analizada. Los amortiguadores que se usan para lavar la columna
constituyen la fase móvil.
El empaque de las
columnas puede separar moléculas por su tamaño, por sus interacciones iónicas o
por interacciones hidrofóbicas. El tipo de empaque a usar dependerá de las
propiedades de la muestra.
Existen otros tipos de
cromatografía más sofisticados, que se usan en laboratorios de investigación y
en procesos de manufactura en varios tipos de industrias. Nosotros nos
limitaremos a los descritos anteriormente.
Práctica:
- Practique el
uso de las micropipeteadoras manuales, midiendo distintos volumenes de tinte
y colocándolos sobre un papel encerado. Mida 5, 10, 20 y 100 microlitros.
- Compare el
tamaño de las gotas sobre el papel.
- Eche los
mismos volúmenes en un microtubo.
- Compare el
tamaño de las gotas en el tubo.
Tengan
especial cuidado con las micropipeteadoras. Las mismas tienen dos puntos de
resistencia, que se sienten al oprimir el émbolo. Al medir un volumen de
líquido, se pone la punta adecuada el el extremo del aparato y se oprime el
émbolo hasta que se sienta esa primera resistencia suave. Se introduce la punta
en el líquido y se suelta el émbolo. Al este subir, se genera el vacío
necesario para succionar el volumen de líquido previamente establecido.
Al
servir la muestra, se oprime el émbolo hasta la primera resisatencia. Se supone
que casi todo el líquido salga de la punta. Oprimir el émbolo hasta la segunda
resistencia para expulsar la última gota de muestra, si quedara algo en la
punta. No volver a soltar el émbolo hasta que haya removido la punta de pipeta
del tubo donde ha estado sirviendo la muestra, para evitar volver a succionar
parte de esta.
Equipo para electroforesis de poliacrilamida (vertical):
Camara de electroforesis horizontal:
Pipeteadoras automaticas.
P2
= 1µL
2÷20
= 10µL
P20
= 10µL
P200
= 100µL
P1000
= 1000µL