BIOL 3010L
Ejercicio #2
Espectrofotometría de
para-nitrofenol
INTRODUCCIÓN
Uno de los instrumentos
principales del laboratorio de biología celular es el espectrofotómetro.
Este instrumento tiene la
capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de un largo de onda
particular) a través de una muestra
y medir la cantidad de luz que es absorbida. Esto le permite al fisiólogo
realizar dos funciones:
1.
Nos da información sobre la
naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo midiendo la
absorbancia a distintos largos de onda y graficar estos valores en función del
largo de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas
propiedades espectrales únicas, distintas sustancias producen distintos
espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un arreglo
tridimensional de átomos particular que hace que cada sustancia tenga
características únicas.
2.
Nos dice cuanta cantidad de
la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. La concentración es
proporcional a la absorbancia, según la Ley Beer-Lambert:
Abs = K C L
Abs: absorbancia
K: coeficiente de extinción molar
C: concentración
L: distancia que viaja la
luz a traves de la muestra. (normalmente es de 1 cm)
La cuveta promedio, que
guarda la muestra, tiene dimensiones internas de un centímetro (L). La ecuación describe una línea recta,
donde el origen es cero, bajo condiciones ideales. Si L es constante (1.0 cm) y
se conoce el valor de K, podemos
calcular C en base a Abs:
Abs / K L = C
La
dilución en serie se hace usualmente preparando seis o siete tubos con un
volumen dado de solvente, digamos 1 ml, en cada uno. Al primer tubo se le añade
un volumen igual (1 ml) de la muestra de interés y se mezcla bien. El tubo
tendrá entonces una proporción 1:1 de solvente a sustancia experimental. Es muy
importante mezclar bien para distribuir uniformemente las moléculas de la
sustancia experimental. De otra forma, habría incongruencias en las lecturas de
absorbancia. De ese tubo 1 se saca un volumen (1 ml) y se echa al tubo 2. Se
mezcla bien, y se sigue el proceso con todos los tubos del 3 al 6 ó 7. Al llegar
al último, se descarta un volumen de la solución diluída. Al hacer esto
obtendermos una dilución en factor de dos: ½ x ½ x ½ x ½ x ½ x ½ x ½, donde un
tubo tiene la mitad de la concentración de la sustancia de interés que el tubo
anterior.
V1C1 = V2C2 , donde V1 y C1 son el
volumen y la concentración de la solución que va a ser diluída, mientras que V2
y C2 son el volumen y la concentración de la dilución.
Un error bien común en este procedimiento
es el cambiar inadvertidamente los tubos
de orden. Es por ello que cada tubo debe estar debidamente rotulado. Otro
problema que se presenta es la contaminación con otras sustancias o
partículas de polvo. Es por ello que los tubos deben manejarse con cuidado para
evitar contaminantes y asegurarse de que están bien limpios antes de usarse. Recuerden
que toda materia presenta absorbancia, y si la muestra presenta partículas
extrañas, estas alterarán la lectura real de absorbancia. En nuestro caso el
aparato hará el ajuste para las moléculas de agua, pero leerá la absorbancia de
todo lo demás.
El espectrofotómetro mide la
absorbancia de una muestra en los espectros de luz uv y visible (200 a 850 nm).
El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de
acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa por una hendidura que
determina la intensidad del haz. Este atraviesa la muestra y llega a un tubo
fotográfico, donde es medido. La cantidad de luz que atraviesa la muestra es el
% de tramitancia. Podemos usar esta unidad o cambiarla a absorbancia usando la
siguiente ecuación.
%T = - Log Abs.
El espectrofotómetro nos puede dar ambos valores a la misma
vez, ahorrando la necesidad de hacer los cálculos. (Tramitancia= cantidad de luz
que atravieza la mezcla; Absorbancia= cantidad de luz que rebota contra las
moléculas suspendidas en la muestra y por lo tanto no la atraviezan: es
absorbida).
Una característica del
instrumento es la necesidad de “blanquear” el aparato antes de cada
lectura. Esto se hace colocando una cuveta con una solución control que tenga todos los componentes
de la reacción menos la sustancia que va a ser medida en el instrumento y
ajustando la lectura a cero absorbancia. El propósito de esto es eliminar el
registro de absorbancia (background) que puedan presentar los demás componentes
de la reacción a ese largo de onda particular. Todas las moléculas presentan
absorbancia porque todas interfieren con el paso de los fotones de luz. Al
Blanquear lo que hacemos es calibrar el aparato para que al tomar la lectura
obvie el registro de absorbancia de aquellas moléculas que no sean las que mos
interesan.
La absorbancia será óptima a un
largo de onda de luz específico para cada tipo de molécula. En este experimento
ensayaremos el proceso por el cual se determina la absorbancia óptima de una
sustancia.
PROPÓSITO DEL EXPERIMENTO:
Determinar las propiedades espectrales de una sustancia orgánica:
paranitrofenol.
Aprender a trabajar con un espectrofotómetro de luz
uv/visible.
Repasar conversión de unidades de
concentración.
Repasar la construcción correcta de una gráfica. ESTO ES MUY
IMPORTANTE PARA FUTUROS EJERCICIOS.
Repasar notación científica.
MATERIALES:
Soluciones de paranitrofenol:
100 μM y 50 μM, diluídas en agua destilada
Agua destilada
Tubos de ensayo LIMPIOS
(Asegurarse de que no tienen partículas)
Porta-tubos (rack)
Cuvetas para espectrofotómetro (2 por grupo)
Espectrofotómetro
Kimwipes, (Usar sólo para limpiar las cuvetas y los emisores del
aparato)
Papel toalla ( para secar los derrames)
PROCEDIMIENTO:
En grupos de 4 personas
Parte I: Determinar el largo
de onda que registre la mayor lectura de absorbancia.
1.
Preparar una solución de
paranitrofenol a 50 μM, o usar la
que está ya preparada.
2.
Preparar un blanco control usando el mismo solvente
en que se encuentra el paranitrofenol, pero que no contenga este reactivo. (en
este caso,AGUA
DESTILADA)
3.
Blanquear el
espectrofotómetro con el blanco control.
4.
Tomar lecturas de
absorbancia desde 260nm a 605 nm, cada 15 nm, “blanqueando” el aparato con el
control antes de cada lectura, usando cuvetas de 1 ml.
5.
Determinar dónde está el
pico más alto.
6.
Repetir las lecturas
alrededor del pico, 15 nm por debajo hasta 15 nm por arriba del pico, en
incrementos de 5 nm. Usar la tablita que no tiene anotados los largos de
onda para anotar los largos de onda
de su pico y las lecturas de absorvancia cada 5 nm.
7.
Preparar una gráfica que
ilustre el espectro de absorbancia amplio del paranitrofenol, y otra que ilustre
el pico.
Parte II: Determinar el
coeficiente de extinción molar de paranitrofenol a 410 nm (o el pico de
absorbancia obtenido).
1.
Preparar una dilución en
serie de paranitrofenol, que vaya desde 100 μM hasta completar 6 tubos de
dilución.
2.
“Blanquear” el aparato al
largo de onda escogido y tomar lectura a cada tubo de dilución. Recuerden
“blanquear” antes de cada lectura.
3. Preparar una gráfica de
Abs vs
concentración y calcular el coeficiente de extinción molar para el paranitrofenol. Es importante tener en
cuenta las concentraciones.
Parte III: Determinar la
concentración de una solución con paranitrofenol.
1.
Anotar el número del
desconocido asignado.
2.
Tomar lectura de absorbancia
de la muestra de paranitrofenol de concentración desconocida.
3.
Determinar concentración
utilizando el coeficiente de extinción calculado en la parte
II.
TABLAS DE
DATOS:
Parte I:
|
Largo de onda (Λ,
nm) |
Absorbancia
(Abs) |
Largo de onda (Λ,
nm) |
Absorbancia(Abs) |
Λ del pico |
Abs del
pico |
|
260 |
|
440 |
|
|
|
|
275 |
|
455 |
|
|
|
|
290 |
|
470 |
|
|
|
|
305 |
|
485 |
|
|
|
|
320 |
|
500 |
|
|
|
|
335 |
|
515 |
|
|
|
|
350 |
|
530 |
|
|
|
|
365 |
|
545 |
|
|
|
|
380 |
|
560 |
|
|
|
|
395 |
|
575 |
|
|
|
|
410 |
|
590 |
|
|
|
|
425 |
|
605 |
|
|
|
Parte II: Dilución en Serie
|
Concentracion |
Absorbancia |
|
100
μM |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Parte III: Concentración de un desconocido
Desconocido #:________________
Absorbancia a ________ nm: ________________
Concentración estimada: __________________
Las siguentes instrucciones
aplican a este y todos los demás laboratorios.
1. Todas las gráficas deben
estar debidamente rotuladas, con sus títulos y los ejes debidamente
identificados.
2. Incluya siempre las unidades
tanto en las gráficas como en los cálculos de
resultados.
3. Tenga siempre en mente las
unidades de las sustancias que han sido utilizadas y construya los ejes de
acuerdo a los datos. Un eje mal construído provoca cálculos erróneos, y
viceversa.
Los resultados deben
incluir:
1.
Gráfica de espectrograma de
paranitrofenol.
2.
Gráfica de espectrograma del
pico de absorbancia.
3.
Todos los cálculos de la dilución
en serie.
4.
Cálculo del coeficiente de
extinción molar. (EN MOLES: cambiar la
concentración de micromoles a moles)
5.
Cálculo de concentración del
desconocido.
