BIOL 3010L
Laboratorio # 10
Extracción de DNA
INTRODUCCIÓN:
El ácido
desoxiribonucleico o ADN (DNA) es la
molécula que guarda el código genético de todas las células. Sin importar que
el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos
tienen el DNA como vehículo de su código genético.
Muchas
de las técnicas de biología molecular incluyen algún tipo de manipulación del
material genético. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado
el conocimien-to del código genético, que ya es posible clonar organismos
enteros. Los procedimientos iniciales eran largos y tediosos y podían pasar
varios días antes de saber con certeza que se había logrado obtener DNA en
calidad y cantidad suficiente para poder manipularlo. Además algunos de los
reactivos usados para estos procesos son tóxicos y mutagénicos. Hoy día podemos
obtener suficiente DNA de buena calidad en unas horas.
Durante
el laboratorio de hoy estaremos utilizando un método rápido para aislar DNA a
partir de tejidos animales. Este se llama "DNeasy Tissue Kit" y es
producido por QIAGEN. Este usa tecnología avanzada de membranas de silicato
para purificar rápidamente DNA celular total sin usar extracciones orgánicas ni
precipitación con etanol.
El
sistema permite una lisis directa seguida de fijación selectiva de DNA a la
membrana. Los contaminantes e inhibidores enzimáticos son removidos por
centrifugación. Luego de la lisis, el procedimiento toma unos 20 minutos. La
lisis se logra usando proteinasa K. Luego se ajusta el pH con amortiguadores
para lograr máxima fijación de DNA a la membrana, durante una corta
centrifugación. Los contaminantes restantes son removidos en dos lavados y el
DNA es eluído en agua o amortiguador. El resultado es DNA listo para usar.
El
tamaño de los fragmentos de DNA obtenidos varían entre los 0.1 a 50 kb,
predominando fragmentos de ~ 30 kb de largo. Estos pueden ser usados para PCR
(reacción en cadena de polimerasa), Southern Blotting, RFLP ( para determinar
presencia de genes marcadores, tipificación de tejidos), etc.
La
cantidad máxima de tejido para lograr aislar DNA varía, dependiendo del tipo de
dicho tejido. En caso de los tejidos animales, la cantidad máxima es de 25 mg.
Si se usa bazo, se reduce a 10 mg porque este tejido es extremadamente denso.
Si se usan cultivos microbiológicos, deben usarse durante la fase temprana de
crecimiento logarítmico a una concentración no mayor de 2 x 109 unidades
formadoras de colonias (cfu) en caso de bacterias y de 5 x 107
cfu en caso de levaduras.
MATERIALES:
Papel
para pesar
Balanza
analítica
Bisturí
Palillos
de dientes
Tubos
de microcentrífuga
Microcentrífuga
Baño
a 55°C
Baño
a 70°C
Etanol
absoluto helado
Procedimiento:
1.
A. Corte y pese 25 mg de
tejido (hígado, timo) en pedazos pequeños, depositar en un tubo de centrifuga
de 1.5 ml, y añadir 180 ml Buffer ATL.
O, en su lugar:
B. Raspe el epitelio
bucal con un palillo de dientes y deposite las células sobre papel para pesar y
verifique el peso de la muestra. Eche en microtubo y añada 180 ml de Buffer ATL.
Asegurarse que la
cantidad correcta de material se utilize.
Para tejidos como el bazo, con un número alto de células para una masa
determinada de tejido, no utilizar más de 10 mg del material.
2.
Añadir 20 ml de proteinasa K, mezclar
por vortex, e incunbar a 55° C hasta que el tejidoeste completamente lisado. Mezclar por vortex ocasionalmente durante el periodo de incubación para
dispersar la muestra.
El tiempo de lisis
varia dependiendo del tejido que se utilize.
Lisis usualmente se completa de 1 a 3 hrs. Si es más conveniente, las muestras pueden
dejarse lisando hasta el otro día.
Luego de la
incubación, el lisado puede parecer viscoso pero no debe estar gelationoso ya
que puede tapar la columna "DNeasy spin". Si esto sucede hay que lisar de nuevo, usando
esta vez menos material
3.
Opcional: Tratamiento de la muestra con Rnasa. Añadir 4ml de RNasa A (100 mg/mL),
mezclar por vortex e incubar por 2 minutos a temperatura ambiente.
Tejidos que estan
activos transcripcionalmete tal como el hígado y los riñones continen niveles
altos de RNA, que copurifican con el DNA
genómico. Este paso es necesario si se requiere DNA libre de RNA
. Este paso se puede omitir si el RNA
residual no es de importancia.
4.
Vortex por 15 s. Añadir 200 ml de Buffer AL a la muestra,
mezclar completamente por vortex e incubar a 70° por 10 min.
Es esencial que la
muestra y el Buffer AL sean mezclados inmediatamente y completamente por vortex
o pipeteando para obtener una solución homogénea.
Un precipitado blanco
se puede formar cuando se le añada el buffer AL. En la mayoría de los casos
este se disuelve durante la incubación a 70° C. El precipitado no interfiere
con el procedimiento de Dneasy. Algunos
tejidos ( baso, pulmones) podrían formar un lisado gelationoso luego de añadir
el Buffer AL. En estos casos, batir
vigorosamente o hacer vortex antes de
añadir el etanol en el próximo paso.
5.
Añadir 200 ml de etanol absoluto (96 -
100%) a la muestra, mezclar
completamente con el vortex.
Es muy importante que
el Buffer AL, y el etanol sean mezclados hasta obtener una mezcla homogénea.
Un precipitado blanco
se puede formar cuando se añada el etanol. Este contiene el DNA de la
muestra. Es esencial que se añada todo
el precipitado a la columna DNeasy spin.
6.
Pipetear la mezcla del paso
5 dentro de la columna DNeasy spin que se encuentra en un tubo de recolección
de 2 mL. Centrifugar a ³6000 x g (8000 rpm) por 1 min.
Descartar lo que pasó por la columna y el tubo de recolección.
7.
Colocar la columna de
DNeasy spin en otro tubo de recolección
de 2 mL, añadir 500ml Buffer AW1, y centrifugar
por 1 min a ³6000 x g (8000 rpm) Descartar lo que pasó por la columna y el tubo de
recolección.
8.
Colocar la columna de DNeasy
spin en otro tubo de recolección de 2
mL, añadir 500 ml de Buffer AW2, y
centrifugar por 3 minutos a velocidad máxima para secar la membrana del
Dneasy. Descartar lo que pasó por la
columna y el tubo de recolección.
Esta centrifagación
asegura que no quede nada de etanol residual.
Luego del paso de
centrifugación, remover la columna de Dneasy spin, cuidadosamente para que esta
no tenga contacto con el tubo de recolección, ya que esto causaría que se
contaminara con etanol. ( Si se
contamina, vaciar el tubo de recolección y reusarlo en otro paso de centrifugación por 1 min a velocidad
máxima.
9.
Colocar la columna de DNeasy
spin en un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 - 2 mL y pipetear 200 ml de Buffer AE directamente a
la membrana de Dneasy. Incubar a
temperatura ambiente por 1 min, y luego centrifugar por 1 min a ³6000 x g (8000 rmp) para eluir.
Eluir con 100 ml (en vez de 200 ml)
aumenta la concentración final de DNA en el eluído, pero también disminuye la
cantidad de DNA que se obtiene.
10. Repetir la elución como descrita en el paso 9.
Un nuevo tubo de
microcentrífuga puede ser utilizado para el segundo paso de elución para
prevenir la dilución del primer eluido. En la segunda elución, el tubo de
microcentrífuga del paso 9 puede ser utilizado para combinar los eluidos.
Nota: No deben ser eluidos más de 200 ml a la vez a un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL ya que la minicolumna
de DNeasy puede tener contacto con el eluido.
11. Determinar el rendimiento de
DNA obtenido.
a.
Diluir 20 ml de muestra de DNA en 980 ml de agua desionizada y esteril (dilución 1/50)
b.
Medir absorbancia a 260 nm
usando cuvetas de 1 ml, que puedan usarse a luz ultravioleta.
c.
La concentración de DNA a A260
= 1.0 en una cuveta de 1 cm equivale a 50 mg de DNA por ml de agua. Para calcular la concentración de la muestra:
[DNA] = 50 mg / ml x A260 x
factor de dilución (50)
[DNA total] =
[DNA] x
volumen eluído en ml
12. Guardar el DNA obtenido para usar en el siguiente laboratorio.
RESULTADOS:
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Material usado |
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Cantidad de material |
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Volumen total eluído (ml) |
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A260 |
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Concentración estimada (mg / ml) |
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