BIOL 3010L

Laboratorio # 10

Extracción de DNA

 

INTRODUCCIÓN:

 

El ácido desoxiribonucleico o ADN  (DNA) es la molécula que guarda el código genético de todas las células. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehículo de su código genético.

            Muchas de las técnicas de biología molecular incluyen algún tipo de manipulación del material genético. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado el conocimien-to del código genético, que ya es posible clonar organismos enteros. Los procedimientos iniciales eran largos y tediosos y podían pasar varios días antes de saber con certeza que se había logrado obtener DNA en calidad y cantidad suficiente para poder manipularlo. Además algunos de los reactivos usados para estos procesos son tóxicos y mutagénicos. Hoy día podemos obtener suficiente DNA de buena calidad en unas horas.

            Durante el laboratorio de hoy estaremos utilizando un método rápido para aislar DNA a partir de tejidos animales. Este se llama "DNeasy Tissue Kit" y es producido por QIAGEN. Este usa tecnología avanzada de membranas de silicato para purificar rápidamente DNA celular total sin usar extracciones orgánicas ni precipitación con etanol.

            El sistema permite una lisis directa seguida de fijación selectiva de DNA a la membrana. Los contaminantes e inhibidores enzimáticos son removidos por centrifugación. Luego de la lisis, el procedimiento toma unos 20 minutos. La lisis se logra usando proteinasa K. Luego se ajusta el pH con amortiguadores para lograr máxima fijación de DNA a la membrana, durante una corta centrifugación. Los contaminantes restantes son removidos en dos lavados y el DNA es eluído en agua o amortiguador. El resultado es DNA listo para usar.

            El tamaño de los fragmentos de DNA obtenidos varían entre los 0.1 a 50 kb, predominando fragmentos de ~ 30 kb de largo. Estos pueden ser usados para PCR (reacción en cadena de polimerasa), Southern Blotting, RFLP ( para determinar presencia de genes marcadores, tipificación de tejidos), etc.

            La cantidad máxima de tejido para lograr aislar DNA varía, dependiendo del tipo de dicho tejido. En caso de los tejidos animales, la cantidad máxima es de 25 mg. Si se usa bazo, se reduce a 10 mg porque este tejido es extremadamente denso. Si se usan cultivos microbiológicos, deben usarse durante la fase temprana de crecimiento logarítmico a una concentración no mayor de 2 x 109 unidades formadoras de colonias (cfu) en caso de bacterias y de 5 x 107 cfu en caso de levaduras.

 

MATERIALES:

           

            Papel para pesar

            Balanza analítica

            Bisturí

            Palillos de dientes

            Tubos de microcentrífuga

            Microcentrífuga

            Baño a 55°C

            Baño a 70°C

            Etanol absoluto helado

 

 

Procedimiento:

 

1.      A. Corte y pese 25 mg de tejido (hígado, timo) en pedazos pequeños, depositar en un tubo de centrifuga de 1.5 ml,  y añadir 180 ml Buffer ATL.

O, en su lugar:

B. Raspe el epitelio bucal con un palillo de dientes y deposite las células sobre papel para pesar y verifique el peso de la muestra. Eche en microtubo y añada 180 ml de Buffer ATL.

Asegurarse que la cantidad correcta de material se utilize.  Para tejidos como el bazo, con un número alto de células para una masa determinada de tejido, no utilizar más de 10 mg del material.

2.      Añadir 20 ml de proteinasa K, mezclar por vortex,  e incunbar a 55° C hasta que el tejidoeste completamente lisado.  Mezclar por vortex ocasionalmente  durante el periodo de incubación para dispersar la muestra.

El tiempo de lisis varia dependiendo del tejido que se utilize.  Lisis usualmente se completa de 1 a 3 hrs.  Si es más conveniente, las muestras pueden dejarse lisando hasta el otro día.

Luego de la incubación, el lisado puede parecer viscoso pero no debe estar gelationoso ya que puede tapar la columna "DNeasy spin".  Si esto sucede hay que lisar de nuevo, usando esta vez menos material

3.      Opcional:  Tratamiento de la muestra con Rnasa.  Añadir 4ml de RNasa A (100 mg/mL), mezclar por vortex e incubar por 2 minutos a temperatura ambiente.

Tejidos que estan activos transcripcionalmete tal como el hígado y los riñones continen niveles altos de RNA,  que copurifican con el DNA genómico.  Este paso  es necesario si se requiere DNA libre de RNA .  Este paso se puede omitir si el RNA residual no es de importancia.

4.      Vortex por 15 s.  Añadir 200 ml de Buffer AL a la muestra, mezclar completamente por vortex e incubar a 70° por 10 min.

Es esencial que la muestra y el Buffer AL sean mezclados inmediatamente y completamente por vortex o pipeteando para obtener una solución homogénea.

Un precipitado blanco se puede formar cuando se le añada el buffer AL. En la mayoría de los casos este se disuelve durante la incubación a 70° C.  El precipitado no interfiere con el procedimiento de Dneasy.  Algunos tejidos ( baso, pulmones) podrían formar un lisado gelationoso luego de añadir el Buffer AL.  En estos casos, batir vigorosamente o  hacer vortex antes de añadir el etanol en el próximo paso.

5.      Añadir 200 ml de etanol absoluto (96 - 100%) a la muestra,  mezclar completamente con el vortex.

Es muy importante que el Buffer AL, y el etanol sean mezclados hasta obtener una mezcla homogénea.

Un precipitado blanco se puede formar cuando se añada el etanol. Este contiene el DNA de la muestra.  Es esencial que se añada todo el precipitado a la columna DNeasy spin.

6.      Pipetear la mezcla del paso 5 dentro de la columna DNeasy spin que se encuentra en un tubo de recolección de 2 mL.  Centrifugar a ³6000 x g (8000 rpm) por 1 min.  Descartar lo que pasó por la columna y el tubo de recolección.

7.      Colocar la columna de DNeasy  spin en otro tubo de recolección de 2 mL, añadir 500ml Buffer AW1, y centrifugar por 1 min a ³6000 x g (8000 rpm) Descartar lo que pasó por la columna y el tubo de recolección.

8.      Colocar la columna de DNeasy spin  en otro tubo de recolección de 2 mL, añadir 500 ml de Buffer AW2, y centrifugar por 3 minutos a velocidad máxima para secar la membrana del Dneasy.  Descartar lo que pasó por la columna y el tubo de recolección.

Esta centrifagación asegura que no quede nada de etanol residual.

Luego del paso de centrifugación, remover la columna de Dneasy spin, cuidadosamente para que esta no tenga contacto con el tubo de recolección, ya que esto causaría que se contaminara con etanol.  ( Si se contamina, vaciar el tubo de recolección y reusarlo en otro  paso de centrifugación por 1 min a velocidad máxima.

9.      Colocar la columna de DNeasy spin en un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 - 2 mL y pipetear 200 ml de Buffer AE directamente a la membrana de Dneasy.  Incubar a temperatura ambiente por 1 min, y luego centrifugar por 1 min a ³6000 x g (8000 rmp) para eluir.

Eluir con 100 ml (en vez de 200 ml) aumenta la concentración final de DNA en el eluído, pero también disminuye la cantidad de DNA que se obtiene.

10.  Repetir la elución como descrita en el paso 9.

Un nuevo tubo de microcentrífuga puede ser utilizado para el segundo paso de elución para prevenir la dilución del primer eluido. En la segunda elución, el tubo de microcentrífuga del paso 9 puede ser utilizado para combinar los eluidos.

 

Nota: No deben ser eluidos más de 200 ml a la vez a un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL ya que la minicolumna de DNeasy puede tener contacto con el eluido.

 

11.  Determinar el rendimiento de DNA obtenido.

a.       Diluir 20 ml de muestra de DNA en 980 ml  de agua desionizada y esteril (dilución 1/50)

b.      Medir absorbancia a 260 nm usando cuvetas de 1 ml, que puedan usarse a luz ultravioleta.

c.       La concentración de DNA a A260 = 1.0 en una cuveta de 1 cm equivale a 50 mg de DNA por ml de agua. Para calcular la concentración de la muestra:

[DNA] = 50 mg / ml  x  A260  x  factor de dilución (50)

 

[DNA total] = [DNA]  x  volumen eluído en ml

 

12.  Guardar el DNA obtenido para usar en el siguiente laboratorio.

 

 

 

 

 

 

RESULTADOS:

 

 

Material usado

 

 

Cantidad de material

 

 

Volumen total eluído

(ml)

 

A260

 

 

Concentración estimada

(mg / ml)