BIOL 3010L

Ejercicio # 6

Fraccionamiento Celular

 

 

INTRODUCCIÓN:

 

Cuando un científico está estudiando algún componente bioquímico celular, en algún momento tendrá la necesidad de aislar dicho componente de un tejido o una bacteria. Para comprobar que ha logrado obtener la sustancia deseada deberá realizar estudios cualitativos y/o cuantitativos para determinar presencia y concentración.

Una célula bacteriana puede dividirse en tres partes: periplasma, membrana y citoplasma. Esto se logra usando digestión enzimática del periplasma con lizosima en una solución hipertónica. Luego se centrifuga la reacción para precipitar los esferoplastos dejando el periplasma en el sobrenadante. El resuspender los esferoplastos en agua (solución hipotónica), causará el rompimiento de las membranas. Una centrifugación más veloz precipitará las membranas dejando el citoplasma en el sobrenadante. Los tres fragmentos celulares luego son analizados para la presencia de la enzima.

En el laboratorio de hoy aislaremos una enzima, fosfatasa alcalina, y determinaremos su actividad. La fosfatasa alcalina cataliza la hidrólisis de sustancias orgánicas monofosfatadas produciendo un alcohol y un fosfato inorgánico.

 

 

OBJETIVOS: 

 

            Separar componentes celulares de una bacteria:

            Ver el efecto de lizosima sobre la pared celular de las bacterias.

            Ver la relación que existe entre la salinidad de un medio y la presión osmótica.

Identificar la presencia de una enzima en fracciones celulares bacterianas.

 

 

MATERIALES:

 

Un matraz con cultivo de bacterias

Lisol para desinfectar el área

Papel toalla

Tubos de centrífuga de 50ml

Tubos de centrífuga de 15 ml

Solución A

10 mM Tris

10 mM EDTA

20% Sucrosa

Solución de lizosima 10 mg/ml 

Tritón X-100

Agua destilada

Tubos de ensayo pequeños

Pipetas de 5 ml

Amortiguador Tris-MgSO4,  pH 9.4

Para-nitrofenil fosfato, 100 mM (sustrato)

1 M NaOH

 

 

PROCEDIMIENTO:

 

Parte I: Centrifugación diferencial

 

1.      Centrifugar 35 ml de cultivo líquido de bacterias por 10 min a 5000 rpm.

2.      Resuspender las células en 2 ml de solución A (Tris-EDTA-Sucrosa).  (solución hipertónica)

3.      Añadir 0.15 ml de lisosima.

4.      Mezclar bien e incubar a temperatura ambiental por 30 minutos.

5.      Centrifugar a 10,000 rpm por 10 minutos.

6.      Guardar el sobrenadante en un tubo marcado P (periplasma)

7.      Resuspender los esferoplastos en 5 ml de agua destilada. (solución hipotónica)

8.      Incubar por 10 minutos a temperatura ambiental.

9.      Centrifugar a 15,000 rpm por 20 minutos.

10.  Guardar el sobrenadante en tubo marcado C (citoplasma)

11.  Resuspender el precipitado en 2 ml de solución de Tritón X-100. (detergente)

12.  Guardar en tubo marcado M (membrana).

 

 

Parte II: Ensayo enzimático.

 

1.      Anotar el volumen de cada fracción con una pipeta. Usar una pipeta por cada fracción.

2.      Tomar 0.2 ml de cada fracción y echar en respectivos tubos (tres fracciones, tres tubos). Echar 0.2 ml de agua destilada en otro tubo, como control.

3.      Añadir a los 4 tubos 0.7 ml de amortiguador de ensayo (Tris-MgSO4, pH 9.5).

4.      Añadir a cada tubo 0.1 ml de sustrato (para-nitrofenil fosfato). Anotar la hora a la que le echó el sustrato)

5.      Incubar a temperatura ambiental por 30 minutos.

6.      A exactamente 30 min, echar 1 ml de 1.0 M NaOH para detener la reacción.

7.      Centrifugar a 1500 rpm en centrífuga clínica por un minuto o hasta precipitar el particulado.

8.      Leer absorbancia a 410 nm a cada tubo de reacción para determinar la concentración de para-nitrofenol generado.

 

 

 

 

 

 

 

Tabla para datos y cálculos:

 

Bacteria (nombre):

 

 

 

 

Fracción P (Periplasma)

Fracción C (Citoplasma)

Fracción M (Membrana)

Volumen obtenido

 

 

 

 

Absorbancia

A410

 

 

 

Concentración de paranitrofenol generado    [p-NP]

 

 

 

Actividad enzimática por minuto       (EA)

 

 

 

Actividad de la muestra

 

 

 

Actividad total en la fracción (TAf)

 

 

 

Actividad celular total (TAA= STAf)

 

Porcentaje de actividad  (TAf/TAA)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CALCULOS:

 

1.      Calcular la concentración de para-nitrofenol para cada fracción usada en el ensayo y para cada tubo en total. Utilice el coeficiente de extinción molar que obtuvo en el experimento #3, Espectrofotometría de paranitrofenol.

 

Abs = KCL      C = [p-NP]

 

2.      Calcular la actividad enzimática para cada fracción (EA):

 

EA = [p-NP] / 30 min = cuántos moles se generan por minuto

 

3.      Calcular la actividad presente en el tubo de ensayo.

 

Activity = EA/ 0.2 ml                          0.2 ml = muestra que usaron para la prueba.

 

4.      Calcular la actividad total  para cada fracción (TAf)

 

TAf = (Activity)  x  (vol  total de fracción)

 

                        vol. total = volumen que midieron de cada fracción recogida.

 

4. Calcular actividad total del ensayo:            TAA = Σ TAf

 

5. Calcular el % de actividad correspondiente a cada fracción:

 

            (TAf  / TAA) x 100 

 

 

 

DISCUSIÓN

 

¿Cuál de sus fracciones presentó más actividad?

 

Busque información adicional sobre la estructura celular de su bacteria. ¿Qué puede inferir sobre la relación entre la estructura y la posición de la enzima en su bacteria?

 

¿Cree que la localización de la enzima tenga que ver con la estructura y el tipo de metabolismo de su bacteria? ¿Por qué sí o por qué no?