BIOL 3010

Ejercicio #4

Determinación de proteínas

INTRODUCCIÓN:

De todas las moléculas de importancia biológica, las proteínas son de las que más se estudian por ser las más versátiles. Muchas proteínas tienen actividad biológica, como por ejemplo las enzimas y las inmunoglobulinas. Otras son proteínas de transporte que facilitan o controlan el movimiento de sustancias a través de las membranas en las células. Otras actúan como hormonas (ej: insulina) y otras como parte estructural de las células (ej: microtúbulos y microfilamentos del citoesqueleto). El Biólogo molecular puede obtener proteínas a partir de fraccionamiento celular. Una vez se separa la célula en sus componentes se procede a aislar las proteínas para su estudio.

Lo mas importante a seguir en la purificación es la recuperacion de la proteína que nosa interesa. Esto puede hacerse por ensayos enzimáticos si es una enzima, bioactividad si es no-enzimática o algún otro método que sea conveniente, como electroforesis o cromatografía de columna.

Lo segundo es conocer la cantidad de proteína presente en la muestra. Existen varios métodos de análisis cuantitativo. El que se use dependerá de la cantidad de proteína esperada, si la muestra analizada debe ser recuperada o si no importa que la muestra sea destruída.

Procedimientos para medir proteína total en una muestra:

Prueba	Mecanismo de acción		Pros	Contras
Biuret-Alkaline copper reagent	Compuestos con dos o mas enlaces péptidos reaccionan con iones cúpricos (Cu2+) en una sln alcalina donde Cu2+ forma complejo con cuatro átomos de N (dos N de cada una de dos cadenas peptídicas). La sln cambia a un color violeta rojizo		Reproducible y confiable	Requiere de 1 a 20 mg de proteina
Lowry-Folin-Ciocalteau Reagent	El reactivo F-C contiene fosfomolibdato y fosfotungstato con constituyentes metálicos oxidados (valencia +6). Estos oxidan residuos de aminoácidos suceptibles en la proteína como el fenólico de tirosina, el indol de triptófano y el sulfhidrilo de cisteina. El resultado es una sal reducida tipo molibdeno, de color azul. La mayoría de las proteínas contienen poco Trp o Cys por lo que el color depende mayormente de la cantidad de Tyr presente en la proteína. La adición de Cu2+ intensifica el color azul 10X		Muy sensitivo, (0.2 a 5m de prot); económico	Color resultante no es constante, por lo que se debe escoger bien los estandares para preparar la curva contra la que se compararán los resultados
Absorción de luz ultravioleta	Se puede realizar a 280 nm (banda de aa aromáticos) o a 205 nm (banda de enlace péptido) A 280 nm la absorbancia dependerá de la cantidad de Tyr o Trp presente en la proteína: si no tiene estos residuos, el coeficiente de extinción será de E₂₈₀=0.0 Lisosima, que tiene muchos Tyr y Trp, E₂₈₀=2.65. Si se conoce la corrección en la absorción (A₂₈₀/A₂₆₀) se puede calcular la concentración de proteínas: [prot] (mg/ml) = A₂₈₀-A₂₆₀ A 205 nm se ve menos el efecto de los residuos, pero siempre hay que corregir para el contenido de Trp y Tyr, y la absorción de las hélices alfa y hojas beta		La muestra puede ser recuperada porque no es destruída en el proceso.	Requiere hasta 1 mg de muestra pura. Acidos nucleicos pueden absorber a 280, por lo que hay que corregir leyendo a A₂₆₀ (Abs máxima de los ácidos nucleicos)
Ensayo de Bradford	El tinte azul de Coomasie 250 tiene absorción máxima a 465 nm. Al unirse a proteína absorbe a 595nm	Sensitivo, constante de una proteína a otra, libre de interferencia por otros componentes celulares y sales. 4X mas sensitivo que Folin-Ciocalteau
Bis-cinchoninic Acid Reagent (BCA)	Basado en la rx de Folin-Ciocalteau.: Proteína + Cu²⁺ alcalino Biuret complex (Cu²⁺ Cu¹⁺) Cu¹⁺ + ácido bis-cinconínico complejo que absorbe a 562 nm		Más conveniente	Muestra variaciones de una proteína a otra.

Por lo general las proteínas absorben luz a entre 210 y 280 nm de largo de onda, en el espectro de luz ultravioleta. Como los espectrofotómetros más comunes en el laboratorio de enseñanza miden la luz a partir de 350 nm (espectro de luz visible), hay que darle a las muestras de proteínas un tratamiento con tintes que les permita absorber luz en el largo de onda de luz visible.

Una de las técnicas más comúnmente usadas es la tinción de Lowry. En esta, se trata la muestra con el tinte Folin-Ciocalteau. Este modifica químicamente los aminoácidos aromáticos de forma que absorben luz en el rango de luz visible (660nm) y pueden ser medidos con el espectrofotómetro común.

(Parte de la información fue obtenida de http://chemistry.uwinnipeg.ca/meze Para mas información concerniente a la purificación de proteínas, pueden acceder este sitio.)

Propósito:

Usar la tinción Lowry para determinar el coeficiente de extinción molar de la albúmina de suero bovino (BSA) con ayuda de un espectrofómetro.

Usar ese coeficiente para calcular la concentración de BSA en una muestra de concentración desconocida.

MATERIALES:

Carbonato de sodio,

Tartrato de sodio, 0.04 g/ml

Sulfato de cobre, 0.02 g/ml

Folin-Ciocalteau

Albúmina de suero bovino, 200 μg/ ml

Agua destilada

Tubos de ensayo, 8 por grupo

Cuvetas para espectrofotómetro de 1 ml, 8 por grupo

Espectrofotómetro

Kimwipes

Pipetas de 1 ml

Micropipetas de 50 μl

Puntas de micropipetas.

Soluciones de BSA de concentración desconocida, numeradas

PROCEDIMIENTO:

1. Identificar las soluciones:

A. Carbonato de sodio básico

B. Tartrato de sodio

C. Sulfato de cobre

D. Solución de Folin-Ciocalteau

E. Albúmina de suero bovino (BSA)

2. Preparar las soluciones de trabajo cuando las vaya a usar:

Solución I: 9.6 ml A

0.2 ml B

0.2 ml C

Solución II: 0.2 ml D

0.8 ml agua destilada

3. Identificar 8 tubos de ensayo limpios como 1, 2, 3, 4, 5, 6, control y desconocido.

4. Preparar una dilución en serie de BSA (sln E, concentración original: 200 μg/ml) por un factor de 2. Preparar 6

tubos con un volumen final de 1.0 ml en cada tubo. Las diluciones se harán en agua destilada. El tubo 1 deberá tener 2.0 ml BSA 200 μg/ml. Los tubos 2 al 6 deberán tener 1.0 ml agua destilada. Comenzar la dilución tomando 1.0 ml de la solución del tubo 1 y echar en el tubo 2. Mezclar bien y sacar del tubo 2, 1.0 ml de solución para echarlo en el tubo 3. Continuar hasta llegar al tubo 6. De ese tubo descartar 1.0 ml de la dilución.

5. Preparar un tubo adicional, el tubo 7, con 1.0 ml de agua destilada (control) y otro tubo (el 8) con 1.0 ml de desconocido. (Total de 8 tubos).

6. Anotar el número del desconocido.

7. A cada tubo, incluyendo control y desconocido, echar 1.0 ml de solución I, mezclar bien y dejar reaccionando por 10 minutos.

8. A cada tubo añadir 100 μl de Solución II, mezclar bien y dejar reaccionando por 10 minutos más.

9. Preparar el espectrofotómetro a 660 nm y blanquear con el control.

10. Leer la absorbancia de todos los demás tubos.

11. Anotar los resultados de absorbancia en la tabla de datos que sigue a continuación. Demostrar los cálculos de concentración.

12. Graficar la absorbancia de cada tubo de concentración conocida en función de su concentración y determinar el coeficiente de extinción molar para BSA.

Abs = K C L, K= Abs / C L, L = 1 cm

12. Determinar la concentración del desconocido.

C = Abs / K L

TABLAS DE DATOS:

Muestra	Concentracion	Absorbancia
1
2
3
4
5
6
Desconocido # Muestra______

PREGUNTAS GUÍA:

1. ¿Cuál es la apariencia de las soluciones antes, durante y después de la reacción?

2. ¿Qué relación observa entre el color de la reacción y la absorbancia?

3. ¿El valor calculado de la concentración de BSA desconocida concuerda con el valor que tendría si lo buscara directamente por las coordenadas en la gráfica? Muestre en la gráfica el punto determinado por el cálculo de Beer- Lambert y el punto determinado por coordenadas.