Electroforesis de proteínas
en geles de poliacrilamida
Introducción y técnica
básica
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm#Electroforesis
de proteínas en geles de poliacrilamida
La electroforesis de proteínas en geles con una
matriz de poliacrilamida, comunmente denominada electroforesis en
poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide
gel electrophoresis') es sin duda alguna una de las técnicas más
ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. La
electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a
nivel de muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de
proteína.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si
se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la
propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad
de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su
masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración.
Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en
una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de
carga neta (carga total/masa) entre proteínas. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de
poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las
proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al
tamaño y forma de las proteínas..
Una
ventaja importante de los geles de
poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un
amplio rango de pHs, temperatura y fuerza iónica.
Algunas
caraterísitcas destacables de la electroforesis en geles de poliacrilamida son
:
·
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la
acrilamida por acción de un agente
entrecruzador ('cross-linking'), la bis-acrilamida
en presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador se suele utilizar TEMED
(N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y como catalizador
el ión persulfato (S2O8-) que se añade en
forma de persulfato amónico. En
algunas situaciones, como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la
presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se emplean
ribofavina y TEMED.
·
Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxígeno es un inhibidor de la
polimerización. Además, durante la polimerización se libera calor que podría
provocar la formación de burbujas en el seno del gel.
·
La velocidad de polimerización
viene determinada por la concentración de persulfato (catalizador) y TEMED
(iniciador).
·
La porosidad del gel la
determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo
menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida se use.
·
El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separación del gel.
Habitualmente los geles se denominan en función del % de
acrilamida/bisacrilamida que contienen. Así, la mayoría de las proteínas se
separan bien en el rango 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es
mejor para separar proteínas de gran tamaño.
En
función del estado de las proteínas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del
proceso electroforético éstas se clasifican en electroforesis nativas o
desnaturalizantes.
·
una electroforesis
desnaturalizante, la más común, es la que somete a las proteínas a
migración asegurando la completa desnaturalización (pérdida de la estructura
tridimensional). En esta situación la migración es proporcional a la carga y al
tamaño de la molécula pero no a su forma. El agente desnaturalizante más
empleado es el sodiododecilsulfato o
SDS, un detergente.
·
una electroforesis nativa es
la que somete a las proteínas a migración sin desnaturalización. En esta
situación las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño y de su
forma. Además se mantienen en ciertos casos las interacciones entre subunidades
y entre proteínas, separándose los complejos. Los sistemas tampón (buffer)
empleados en estos caso son : tris-glicina
(rango de pH 8.3 a 9.5), tris-borato
(rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-acetato
(rango de pH 7.2 a 8.5).
La electroforesis en geles de acrilamida se puede realizar empleando
sistemas de uno o más tampones, en estos casos se habla de sistemas tampón
continuos o discontinuos. En los sistemas discontínuos el primer tampón asegura
la migración de todas las proteínas en el frente de migración, provocándose la
acumulación de todas las que se han cargado en el pocillo. La separación
realmente comienza a partir del momento en el que el frente de migración
alcanza la frontera del segundo tampón. En el esquema se muestran secuencialmente la
situación en (a) al principio de la electroforesis, (b) durante el proceso de
apilamiento ('stacking') y (c) durante la separación en el gel resolutivo. El primer gel ('stacking') es de mayor
poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH más ácido que
el segundo gel que es el que realmente separa las proteínas. Este sistema es
especialmente adecuado para analizar muestras diluidas sin perder resolución.
Existen
numerosos dispositivos en el mercado para hacer electroforesis en geles de
acrilamida. En la imagen se muestra un ejemplo de sistema comercial de la
empresa BioRad ampliamente utilizado.
SDS-PAGE
SDS-PAGE es la electroforesis de proteínas más
ampliamente usada. Su nombre significa la electroforesis en geles de
poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS ('SDS-polyacrilamide gel
electrophoresis'). Fue descrito por Laemmli (Laemmli (1970), Nature, 277, p.
680). Se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la que las
muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes
(beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS que desnaturaliza
y recubre a la proteína con cargas netas negativas), y se separan como cadenas
polipeptídicas aisladas.
En general se emplean sistemas de dos tampones
(discontínuos). Este sistema permite la separación de volúmenes relativamente
grandes de muestra sin pérdida de resolución. La concentración se produce por
isotacoforesis de la muestra en el primer gel ('stacking'). El efecto de
estrechamiento de las bandas se basa en el hecho de que los iones glicinato,
relativemente cargados negativamente (en el depósito de tampón superior) tienen
una movilidad electroforética inferior que los complejos de proteínas-SDS. que
a su vez tienen menor movilidad que los iones Cl- de los tampones de carge en
el gel de apilamiento ('stacking'). Cuando se conecta la diferencia de
potencial todas las especies han de migrar a la misma velocidad para mantener
el circuito eléctrico. Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la misma
velocidad que los iones Cl- si hay una región de 'field strenght'. 'Field strenght' es inversamente proporcional a
la conductividad que es a su vez proporcional a la concentración, El resultado
es que las tres especies de interés ajustan sus concentraciones de forma que
[Cl-] > [proteína-SDS] > [glicinato]. Como sólo hay una pequeña
concentración de proteína-SDS las tres se concentran en una banda muy delgada
entre las fronteras de migración del Cl- y del glicinato. Cuando el glicinato
alcanza el borde del gel de separación adquiere una mayor carga en el nuevo
medio, con un pH superior, e incrementa su movilidad. A partir de ese momento
la interfase entre el glicinato y el Cl- deja atrás a los complejos de
proteína-SDS que se desplazarán a su propia velocidad.
SDS es un detergente de acción desnaturalizante que
se une a las cadenas polipeptídicas desnaturalizadas con una realción de 1.4 g
de SDS por g de proteína, uniéndose aproximadamente una molécula de SDS por
cada dos aminoácidos de la cadena. Esta unión masiva de moléculas de SDS
bloquea la carga propia de la molécula de proteína y le confiere al complejo
una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las
proteínas acomplejadas con SDS viajen hacia el ánodo. La separación de los
complejos SDS-proteína es proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas
tienen la misma carga por unidad de masa. Se puede entonces determinar el peso
molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un patrón de
proteínas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las proteínas en
los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso
molecular.
La
grafica de la izquierda ilustra la relación lineal entre la distancia
recorrida por la proteína en el gel y el logaritmo de su peso molecular La
grafica de la izquierda ilustra un gel en el que se han separado pas
proteínas por peso molecular
